泛素连接酶TRIM在固有免疫信号通路中的研究进展

张洪海， 张 磊

(山东大学 基础医学院， 济南 250012 )

蛋白泛素化是指泛素分子在一系列酶包括El泛素激活酶，E2泛素结合酶以及E3泛素连接酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。研究表明，蛋白的泛素化修饰在机体的固有免疫应答中发挥重要作用。TRIM属于E3泛素连接酶的一个家族，在人类中包含70多个成员，结构上高度保守。TRIM家族涉及多种的生物学过程，比如细胞凋亡、细胞分化、发育、肿瘤发生等。近年来研究表明，TRIM家族参与天然免疫特别是抗病毒天然免疫调控。本文主要对TRIM家族在天然免疫信号转导方面新的研究进展进行简要综述。

1　TRIM家族蛋白结构

TRIM家族在结构上高度保守，从N端到C端3个保守的结构域依次是RING结构域(RING domain)、1个或2个B-box结构域(B-box domain)、一个卷曲螺旋结构域(Coiled-coil domain)，此外该家族还具有一个可变的C-末端，因此TRIM家族也称为RBCC家族。家庭成员缺乏RBCC基序中任何结构域之一，其他结构域在顺序和空间上仍是保守的。分析这些结构域的结构特征能够增加我们对于TRIM蛋白功能的理解。

RING 结构域，一般都始于N端的，包含有40～60个氨基酸残基，是一种能够结合2个锌原子的锌指结构域，富含半胱氨酸和组氨酸，在功能上具有 E3泛素连接酶活性，可以介导蛋白自身或不同底物的泛素化[1]。研究表明有些TRIM蛋白的RING结构域可以提高蛋白的稳定性。

B-box结构域同样是一种能够结合锌离子的结构域，有B1和 B2两种类型。二者的不同之处在于保守的半胱氨酸和组氨酸残基的数目和空间位置不同。B-box只在TRIM蛋白中发现，极有可能是该家族中重要的决定簇。

卷曲螺旋结构域(Coiled-coil)，是由多个α-螺旋相互缠绕组成的典型超二级结构。该结构域主要介导TRIM蛋白以及TRIM蛋白和其他蛋白之间的同源或异源的寡聚作用，促进大分子聚合体的形成，另外还能决定TRIM蛋白的亚细胞定位。

TRIM 家族蛋白通常在RBCC结构域后会有不同长度和组成的一个或两个C 端结构域。PRY-SPRY是TRIM家族C端最为常见的结构域。61个氨基酸残基PRY和140个氨基酸残基的 SPRY融合在一起形成 B30.2 结构域，该结构域可能参与蛋白和蛋白的相互作用[2]。

2　TRIM蛋白调控天然免疫信号转导

2.1　TRIM蛋白与TLR信号通路

目前为止，科学家已经在人和鼠中分别发现了10和12个不同的TLRs，它们主要表达在巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞上。TLRs识别相应的配体后，通过其胞内的TIR结构域募集MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88)和TRIF(TIR domain-containingadapter inducing interferon-β)。MyD88通过下游一系列信号转导活化TAK1(TGF-activated kinase 1)，TAK1进而活化IκB激酶(IKK)复合物，IKK复合物活化NF-κB通路，启动炎症反应。另外TLR3/4还可以通过TRIF通路，活化转录因子IRF(IFN-regulatory factor)促进I干扰素的产生。

(3)将位于人行横道上游10 m的公交停靠站移至人行横道下游处，减少行人过街的视线阻碍，同时也能减缓此处的人流拥堵现象。

TRIM5HIV-1病毒核心蛋白进入靶细胞后，诱导TRIM5二聚化，并且形成一个6聚体格结构。在UBC13-UEV1A的参与下，TRIM5合成非锚定的K63连接的泛素化链，TAB2(TAK1-associated Ub-binding protein 2)识别K63的泛素链，进而发生自身多聚化，激活TAK1，促进NF-κB信号通路活化[3]。

TRIM9 NF-κB结合蛋白IκBα降解以及前体蛋白P100的剪接分别在经典和非经典NF-κB通路中都发挥重要作用。β-转导重复蛋白(β-TrCP)是其E3泛素连接酶Skp-Cullin-F-box复合体的一部分，可以识别IκBα和P100，进而促进IκBα的蛋白酶体降解以及P100的剪接。因此β-TrCP在经典和非经典NF-κB通路中都发挥重要作用。TRIM9是神经元特异性TRIM蛋白，通过与β-TrCP的WD40结构域结合，阻止了β-TrCP与底物的结合，从而抑制IκBα降解以及P100的剪接，最终抑制NF-κB活性[4]。

TRIM22在巨噬细胞中，有研究发现过表达TRIM22可以激活NF-κB报告基因活性，并且过表达TRIM22能够促进炎性细胞因子的分泌，表明TRIM22能够促进NF-κB通路的活化。然而，Qiu等发现在293T细胞中，过表达TRIM22抑制TRAF6介导的NF-κB信号通路的活化，其机制是TRIM22降低TRAF6的自泛素化，诱导TAB2的降解，最终导致TRAF6介导的NF-κB通路的抑制[5]。为了明确TRIM22在NF-κB信号通路中的作用，仍然需要通过TRIM22敲基因鼠或者通过CRISPR技术敲除细胞系来实现。

TRIM23有研究表明人巨细胞病毒(HCMV)基因产物UL144以TRAF6依赖的方式激活NF-κB，促进趋化因子CCL22的表达。TRIM 23 存在一个Rab受体结构域，可以与UL144直接结合，从而促进TRAF6定位于核周，与UL144结合，介导的NF-κB的活化[6]。另外，在TLR3通路中，TRIM23可以通过K27连接的多聚泛素化作用于NEMO，从而促进TLR3介导的抗病毒作用[7]。

TRIM30α其产生依赖于NF-κB信号通路的活化，可与TAB2-TAB3复合物相互作用，抑制TRAF6的自身泛素化，抑制TRAF6诱导的NF-κB活化。因此，TRIM30α作为一个反馈机制来调节TLR介导的NF-κB的活化[8]。

TRIM38TLRs识别PAMP，招募MyD88，促进TRAF6和TAK1的活化，导致NF-κB和MAPK信号通路的活化。Zhao等发现TRIM38可以与TRAF6结合，随后介导TRAF6的K48连接的多聚泛素化，最终被蛋白酶体降解[9]。另外，TRIM38还能够与TAK1结合蛋白 TAB2 / TAB3相互作用，以不依赖于泛素的溶酶体途径降解TAB2和 TAB3[10]。

2.2　TRIM蛋白与RLR信号通路

对于外源RNA，胞内RIG-I识别带有5′三磷酸的病毒RNA，而MDA5识别长链RNA。在识别RNA后，RIG-I/MDA5发生构象改变，将信号传递给线粒体抗病毒信号蛋白MAVS。激活的MAVS招募TRAF3、 TRADD等形成信号复合体，然后激活TBK1。活化的TBK1磷酸化IRF3，IRF3发生二聚化，进入细胞核诱I型干扰素的表达。

TRIM11高表达TRIM11可以明显抑制IRF3的磷酸化和二聚化以及IFN-β的产生，因此细胞中病毒的复制增加。而敲除后，则作用相反。进一步研究显示，TRIM11通过其CC结构域与TBK1的CC2结构域相互作用，而TBK1结合蛋白NAP1、SINTBAD、TANK能够增强它们的相互作用[11]。

TRIM13TRIM13可以特异性与MDA5相互作用并通过MDA5负向调控IRF3介导的IFN产生，脑心肌炎病毒(EMCV)可以被MDA5识别，EMCV感染的TRIM13敲基因小鼠产生大量的I型干扰素并且小鼠存活率明显增加。但是，SeV(主要被RIG-I识别)感染后，TRIM13敲基因小鼠和对照小鼠I型干扰素表达没有明显差异[12]。

TRIM14定位于线粒体外膜上，可以与MAVS相互结合。病毒入侵时，TRIM14经历K63位多聚泛素化，招募NEMO到MAVS信号小体，进而促进IRF3和NF-κB活化，促进I型干扰素的表达[13]。

TRIM26有研究表明，病毒感染可以促进TRIM26的核易位，与核内的IRF3结合，降解核内的IRF3，负调IFN-β生产和抗病毒反应[14]。Ram等发现在RNA病毒刺激后，TRIM26通过其自身的K27泛素化募集NEMO，结合并活化TBK1，继而活化下游的IRF3，从而正向调节IFN-β生产[15]。这两个相反的结果说明TRIM26在机体早期和晚期的抗病毒反应作用是不同的，为了进一步明确TRIM26的功能需要通过敲基因小鼠来完成。

TRIM31在RNA病毒感染时，TRIM31被招募至线粒体上，通过C端结构域与MAVS的N端结构域结合，并对MAVS进行K63多聚泛素化修饰，促进MAVS多聚化的形成，活化下游IRF3，从而抵御病毒入侵[16]。

TRIM38Zhao等[9]研究显示，利用siRNA敲低TRIM38，IFN-β的表达明显增强。通过免疫共沉淀发现，TRIM38可以与NF-κB活化激酶相关蛋白1结合(NAP1)，介导NAP1 的K48连接的多聚泛素化并将其降解，最终负向调节RIG-I介导的IFN-β信号通路。

TRIM65Lang等研究发现，TRIM65缺失后， MDA5活化剂以及EMCV诱导的I型干扰素的表达明显下降，但是对RIG-I、TRL3以及cGAS信号通路没有影响。进一步研究证明，TRIM65促进MDA5信号通路是通过对其K743进行K63的泛素化修饰，从而促进MDA5的寡聚化及活化[17]。

2.3　TRIM蛋白与DNA受体介导的信号通路

能够识别外源DNA的分子统称为DNA受体，例如cGAS、Mre11、 IFI16(p204)、 DDX41等。cGAS作为最重要的DNA受体，结合DNA后，催化合成第二信使cGAMP，cGAMP结合内质网上的STING， STING迅速二聚化，然后从内质网经过高尔基体转移到核外周小体上，激活TBK1，进而TBK1磷酸化IRF3，磷酸化的IRF3进入细胞核，从而诱导靶基因的表达。

TRIM14有研究发现，TRIM14除了参与RLR通路外，TRIM14也参与cGAS介导的DNA信号通路。HSV-1感染后，诱导TRIM14表达，进一步TRIM14募集USP14(Ubiquitin-Specific Protease14)对cGAS K414多聚泛素化链进行剪切，进而抑制cGAS通过自噬的降解[18]。

TRIM21在髓系DC中，DDX41是识别胞内双链DNA的传感器，通过下游的STING引发I型干扰素的应答反应。TRIM21通过SPRY-PRY结构域与DDX41的DEADc结构域结合，使 DDX41的9位和115位的赖氨酸发生K48连接的多聚泛素化，降解DDX41，从而负向调节胞内双链DNA引起的固有免疫应答[19]。

TRIM38在对DNA信号通路研究中发现，TRIM38在非感染的细胞以及感染早期可以对cGAS进行苏素化修饰，从而阻止了cGAS的泛素化降解，此外在感染早期TRIM38也可以苏素化修饰STING，从而促进了STING活化，以及下游基因的表达。这些结果提示，TRIM38在cGAS介导的DNA信号通路中起着重要的作用[20]。

TRIM56在HEK293细胞中过表达TRIM56可以明显增强IFN-β启动子活性，其机制主要是对STING进行K63连接的多聚泛素化修饰，进而引发STING的二聚化，二聚化的STING招募TBK1，最终诱导I型干扰素的表达。

3　小结与展望

综上所述，TRIM分子通过多种作用方式，在不同层次上参与调控天然免疫信号转导。虽然不同的 TRIM分子参与天然免疫信号转导的机制不同，但多与其 E3 泛素连接酶活性有关。目前对 TRIM 分子在固有免疫中的研究已经取得了很大的突破，但仍有很多问题没有解决。比如，多个TRIM分子调控一个靶分子，它们的功能是否冗余？是否有协同作用？一个TRIM分子可以调控多个天然免疫信号通路，其生理意义是什么？在病毒或细菌感染中，这些TRIM分子如何通过网络作用来调节机体的免疫反应？另外TRIM 分子在不同种属间调控信号转导的具体分子机制是否一致还未可知，是否在适应性免疫方面发挥功能还没见系统报道。超过一半的TRIM分子参与天然免疫信号的调节，包括NF-κB和IFN信号通路。除了参与炎症通路外，NF-κB还可以通过细胞增殖和细胞凋亡的抑制作用成为致癌活化剂。因此，TRIM分子可能作为免疫应答和致癌作用的双重调节剂。最近研究发现天然免疫细胞在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。那么TRIM家族是否通过调节天然免疫细胞的功能从而影响肿瘤的进程，需要进行深入的研究。

TRIM蛋白具有多种生物学功能，包括抗HIV，调节细胞增殖与分化，调控固有免疫、致癌、自噬等方面。因此，TRIM分子可能是连接不同信号通路或不同系统的节点分子。研究TRIM分子参与调控机体天然免疫调控机制，不仅可以完善天然免疫信号转导的调控网络，还为TRIM分子的其他生物学功能提供了理论基础。同时也为抗感染药物的设计提供新的靶点，对预防和治疗人类感染性疾病具有重要意义。

[1]FREEMONT P S. Ubiquitination: ring for destruction? [J]. Current Biology, 2000, 10(2):R84-R87.

[2]GRÜTTER C, BRIAND C, CAPITANI G, et al. Structure of the pryspry-domain: implications for autoinflammatory diseases [J]. FEBS Lett, 2006, 580(1):99-106.

[3]PERTEL T, HAUSMANN S, MORGER D, et al. Trim5 is an innate immune sensor for the retrovirus capsid lattice [J]. Nature, 2011, 472(7343):361-365.

[4]SHI M, CHO H, INN K S, et al. Negative regulation of nf-kappab activity by brain-specific tripartite motif protein 9 [J]. Nat Commun, 2014, 5:4820.

[5]QIU H, HUANG F, XIAO H, et al. Trim22 inhibits the traf6-stimulated nf-kappab pathway by targeting tab2 for degradation [J]. Virol Sin, 2013, 28(4):209-215.

[6]POOLE E, GROVES I, MACDONALD A, et al. Identification of trim23 as a cofactor involved in the regulation of nf-b by human cytomegalovirus [J]. J Virol, 2009, 83(8):3581-3590.

[7]ARIMOTO K, FUNAMI K, SAEKI Y, et al. Polyubiquitin conjugation to nemo by triparite motif protein 23 (trim23) is critical in antiviral defense [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(36):15856-15861.

[8]SHI M, DENG W, BI E, et al. Trim30 alpha negatively regulates tlr-mediated nf-kappa b activation by targeting tab2 and tab3 for degradation [J]. Nat Immunol, 2008, 9(4):369-377.

[9]ZHAO W, WANG L, ZHANG M, et al. E3 ubiquitin ligase tripartite motif 38 negatively regulates tlr-mediated immune responses by proteasomal degradation of tnf receptor-associated factor 6 in macrophages [J]. J Immunol, 2012, 188(6):2567-2574.

[10]HU M M, YANG Q, ZHANG J, et al. Trim38 inhibits tnfalpha and il-1beta-triggered nf-kappab activation by mediating lysosome-dependent degradation of tab2/3 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(4):1509-1514.

[11]LEE Y, SONG B, PARK C, et al. Trim11 negatively regulates ifnb production and antiviral activity by targeting tbk1 [J]. PloS One, 2013, 8(5):e63255.

[12]NARAYAN K, WAGGONER L, PHAM S T, et al. Trim13 is a negative regulator of mda5-mediated type i interferon production [J]. J Virol, 2014, 88(18):10748-10757.

[13]ZHOU Z, JIA X, XUE Q, et al. Trim14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-i-like receptor-mediated innate immune response [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(2):E245-E254.

[14]WANG P, ZHAO W, ZHAO K, et al. Trim26 negatively regulates interferon-beta production and antiviral response through polyubiquitination and degradation of nuclear irf3 [J]. PLoS Pathog, 2015, 11(3):e1004726.

[15]RAN Y, ZHANG J, LIU L L, et al. Autoubiquitination of trim26 links tbk1 to nemo in rlr-mediated innate antiviral immune response [J]. J Mol Cell Biol, 2016, 8(1):31-43.

[16]LIU B, ZHANG M, CHU H, et al. The ubiquitin e3 ligase trim31 promotes aggregation and activation of the signaling adaptor mavs through lys63-linked polyubiquitination [J]. Nat Immunol, 2017, 18(2):214-224.

[17]LANG X, TANG T, JIN T, et al. Trim65-catalized ubiquitination is essential for mda5-mediated antiviral innate immunity [J]. J Exp Med, 2017, 214(2):459-473.

[18]CHEN M, MENG Q, QIN Y, et al. Trim14 inhibits cgas degradation mediated by selective autophagy receptor p62 to promote innate immune responses [J]. Mol Cell, 2016, 64(1):105-119.

[19]ZHANG Z, BAO M, LU N, et al. The e3 ubiquitin ligase trim21 negatively regulates the innate immune response to intracellular double-stranded DNA [J]. Nat Immunol, 2013, 14(2):172-178.

[20]HU M M, YANG Q, XIE X Q, et al. Sumoylation promotes the stability of the DNA sensor cgas and the adaptor sting to regulate the kinetics of response to DNA virus [J]. Immunity, 2016, 45(3):555-569.