鲎试剂产业在中国的发展现状及相关建议

颜明艳， 王 月， 顾华鑫， 王有基， 李琼珍， 范志锋， 孙 彬， 胡梦红

(1. 上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306; 2. 广西壮族自治区水产研究所，南宁 530021)

鲎(Horseshoe crab)，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、肢口纲(Merostomata)、剑尾目(Xiphosura)，有“活化石”之称。现今世界上仅存二亚科三属的4种鲎，分别为圆尾鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda)、中国鲎(Tachypleustridentatus)、南方鲎(Tachypleusgigas)和美洲鲎(Limuluspolyphemus)。近年来，有关鲎生物学方面的研究进展迅速。鲎血液中含有多种活性物质，这些活性物质的生物活性不仅可以起到抗菌、抗病毒的作用，甚至能抑制肿瘤细胞生长、诱导癌细胞分化。

早在1956年人们就开始了对鲎血液及其与细菌内毒素关系的研究[1]。此后，鲎试剂的应用渗入到各个领域，如检测生物学、医学研究、食品加工等方面。范林等[2]研究发现，鲎试剂动态浊度法可准确检测重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素。Solano等[3]发现鲎试剂可用于检测抗蛇毒血清的内毒素含量。

鲎试剂按其来源可分为两种，一种是中国鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate)，缩写为TAL，原材料为中国鲎血液；另一种是美洲鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate)，缩写为LAL，提取自美洲鲎的血液。TAL与LAL的功能相同。世界上拥有鲎资源的国家并不多，而我国占有世界上95%的中国鲎资源[4]。我国生产鲎试剂的原材料主要提取自中国鲎的血细胞[5]。目前，在福建厦门、广东湛江、广西北海等鲎栖息地集中分布了我国生产鲎试剂的工厂。

1　鲎试剂的生产工艺和应用领域

鲎工厂采集鲎血液的步骤：1)抓捕。在鲎栖息地捕捉中国鲎。2)运输。在密封的空间运输，同时将鲎身上的沙子等杂物去除，检查中国鲎是否受伤(鲎试剂厂不采集受伤鲎的血液)。3)提取血液。将与鲎细胞接触的所有玻璃器皿严格消毒，用1%碘酒，70%酒精对中国鲎头胸腹部关节部位进行消毒，之后用玻璃插管直接插入鲎心脏包膜让血液经插管流入装有抗凝剂的贮存瓶中，每只鲎大约采100 mL血液，保持抗凝剂与采血量体积比为1∶1。4)放生。采完血的鲎在当天带到距被捕地大约113～129 km的地方放生，防止短时间再次被捕采血。研究显示适量抽血不会影响鲎的生活和生殖能力[6]，但需要足够的时间才能使采血鲎恢复健康。

鲎试剂是一种生物试剂，其提取过程是先从中国鲎的蓝色血液中分离出变形细胞，然后提取细胞溶解物后经低温冷冻干燥形成鲎试剂。鲎试剂按实验方法可分为凝胶法鲎试剂和光度测定法鲎试剂(浊度法和显色基质法)。其中，凝胶法鲎试剂是定性检测或半定量内毒素的方法，其原理是与内毒素反应产生凝集。而光度测定法鲎试剂则是定量检测内毒素的方法。鲎试剂按使用特点可分为4种，分别为普通鲎试剂、高灵敏度鲎试剂、特异性鲎试剂及定量法鲎试剂。不同分类的鲎试剂的灵敏度不同，制备方法也略有不同，本文介绍了其中一种较为普遍的制备方法。其具体制备过程是将采集到的与抗凝剂混合的鲎血用三羟氨甲烷等缓冲液将pH调至7.1±0.3，然后以1600 r/min的速度离心10 min，收集其沉淀细胞后加洗涤液(如3%NaCl)洗涤3次，离心除去洗液后得到浓集的鲎血细胞，在其中加入3倍量的崩解液(注射用水、0.9%NaCl注射液等)，摇匀密封，在4℃下冷藏24 h后再离心10 min，速度为3000 r/min，除去细胞破裂后的碎片，取得的上清液即是变形细胞溶解物。然后进行灵敏度标定。标定后将其分装并冻干封口得到成品鲎试剂[7]。

鲎试剂是目前检测内毒素最有效、最简便的试剂。因其操作简单、灵敏度高等优点在药品检验、食品、医疗用具、临床医学研究等多个领域均有应用。鲎试剂产生凝集是一系列酶反应的过程。细胞浆颗粒存在于鲎血细胞中，其含有一种酶系统，包括B因子(factor B)、C因子(factor C)、凝固酶原(proctting enzyme)和凝固蛋白原(coagulogen)，功能是与内毒素起凝集作用。具体过程为：C因子被内毒素激活，而B因子则被活化C因子启动成为活化B因子，活化B因子会激活凝固酶原生成凝固酶，而凝固蛋白原由于凝固酶的酶解作用转变为凝固蛋白，最后，凝固蛋白通过交联酶作用产生凝集反应[8]。在凝固酶原和G因子存在条件下，鲎试剂还可与CMPS类物质产生凝集作用[9]。

2　鲎试剂产业在中国的发展现状

我国现有的鲎试剂厂主要分布在福建厦门、广东湛江、广西北海等中国鲎栖息地。例如作为国内最早生产鲎试剂的厂家的福建厦门鲎试剂生物科技股份有限公司于1987年就已经成功研制出鲎试剂，该公司的特异性鲎试剂(即弃G因子鲎试剂)是国内首创产品，于1995年开始批量生产。该试剂可以避免G因子旁路对其的干扰，且只对内毒素起反应，使得检测结果更加可靠，无论是在药检还是临床检验方面都是必不可少的检测试剂。目前该公司已有透析专用鲎试剂盒、显色基质鲎试剂、凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、特异性鲎试剂、内毒素等一系列鲎试剂产品。其中，2005年推出的显色基质定量鲎试剂盒使用简单方便，抗干扰能力强，灵敏度高达0.005 EU/mL，质量也已达到国际领先水平。福州新北生化工业有限公司，也是一家以研发、生产鲎试剂及其他各种生物试剂产品的企业。该公司不仅有在药品领域中检测注射药品中热原质的产品，还有在临床领域检测人体血液中细菌内毒素和真菌多糖的试剂盒。在广东，如湛江博康海洋生物有限公司，也已从事细菌内毒素检测与鲎试剂研究和生产30多年，是全球早期成功研究鲎试剂的专业生产企业，该公司于2012年研制的“真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒(动态浊度法)”产品，打破了美国在该项技术领域的垄断。此外，北海兴龙生物制品有限公司、湛江安度斯公司等专业生产中国鲎试剂(TAL)及相关产品的公司，其产品也获得国内外的广泛认可。

3　鲎试剂相关产业发展面临的问题

3.1　研究基础薄弱

鲎试剂产业作为新兴产业，我国对其的研究较少，基础还较为薄弱。我国生产的鲎试剂与国际同类产品有一定差距，具体表现在鲎试剂的灵敏度、质量、稳定性、各支的均一性及内毒素各种标准品、鲎试剂对照品等方面。深入研究鲎试验反应动力学机制并完善以其为基础的内毒素定量分析技术已刻不容缓。

3.2　原材料供应逐年下降

以年产量150万支的鲎试剂公司为例，每年需要5000对(即1万只)成年鲎提供血源。然而，作为原材料的中国鲎数量却急剧减少，远不能满足鲎试剂厂对中国鲎血液的需求。翁朝红等[10]调查发现，中国鲎在浙江舟山地区几近绝迹，福建东山湾海域每年被捕数量也仅千对。从前在中国东部和南部沿海比比皆是的中国鲎，现在大部分海域已经找不到其踪迹了。不仅上岸产卵的成鲎寥寥可数，潮间带上的幼鲎也非常少见。广西北部湾是我国中国鲎的主要栖息地，但栖息于此的中国鲎数量正在逐年减少，从20世纪90年代以前的60～70万对减少到2010年的每年约30万对[11]。我国中国鲎资源已经面临枯竭。作为原材料的中国鲎枯竭将直接导致鲎试剂产业的停滞不前。

3.3　鲎试剂的质量标准不够完善

尽管我国对于鲎试剂的质量制定了相关政策，但目前，我国对于鲎试剂相关产业的重视程度不够高，相关政策的执行力度不够严格，加上相关部门的监督力度不够，导致了鲎试剂质量的参差不齐，且鲎试剂容易受到多种不稳定因素的影响，如鲎动物个体差异、制备过程中器具消毒不严格等，致使同一厂家批号不同的鲎试剂质量也有所差异，这使得鲎试剂灵敏度的复核值与其标示值不尽相同。规范鲎试剂的质量标准，加大对鲎试剂灵敏度的复核监测力度等措施对于鲎试剂的质量至关重要。

4　建议

中国鲎资源锐减将直接影响鲎试剂产业的发展。早在20世纪80年代，我国科学工作者就开始呼吁保护鲎资源，但受限于当时的人口增长、经济缺乏发展等因素，我国的鲎资源并没有受到应有的保护[12]。中国鲎从卵细胞受精至性成熟需要13～15年的时间[13]，这漫长的生长时间使得中国鲎资源的恢复十分困难。因此，为了中国鲎试剂产业的可持续发展，开展中国鲎的人工繁育、野外放流、栖息地保护等工作刻不容缓。此外，提高鲎试剂提取效率、完善鲎试剂的制造工艺，规范采血技术，减少对采血鲎的伤害，立法保障采血鲎的放生等举措对于鲎试剂的可持续发展也不可或缺。具体建议如下。

4.1　规范鲎试剂质量标准

不同厂家甚至是同一厂家不同批次的鲎试剂在质量参数、生产工艺等方面都会有不同程度的差异。这将导致鲎试剂检测内毒素的结果不准确。因此，研究影响鲎试剂质量的因素并制定相应的质量标准对保证鲎试剂质量至关重要。鲎试剂制备的关键在于其灵敏度、稳定性及自身凝集等。一般要求稳定的灵敏度，大于24 h的自凝时间，适宜的pH、具有一定的缓冲能力等。达不到标准的鲎试剂，既浪费了宝贵的中国鲎蓝色血液，也会导致细菌内毒素的检测结果不准确。

确定鲎试剂质量标准既需要得到国家的重视，有关部门监督复核鲎试剂灵敏度的力度也应加强。确定出厂鲎试剂的质量标准，使我国鲎试剂工厂有统一的质量标准，增加了鲎试剂内毒素检查准确性的同时，也为鲎试剂的进一步发展奠定了坚实的基础。

4.2　规范鲎试剂厂的采血过程

鲎试剂企业不可因盲目追求一时的利益而过度捕捞鲎、随意加大采血剂量等，应注重长期发展，做好中国鲎的保护工作。在中国鲎的运输过程中应注意对鲎的保护，不采受伤的中国鲎的血液。在采血过程中则应该注意无菌消毒和采血的量。利用完中国鲎要放回原栖息地，不能为了节约成本而随意丢弃，且要离抓捕地113～129 km处放生，防止中国鲎还没有完全康复就再次被捕捉采血，从而导致中国鲎的死亡。

企业可以和科学工作者合作研究采血后的鲎所需的营养以及怎样使血细胞快速恢复，以利于企业暂养采血鲎一段时间，并在短时间多次采血后再放回。人工饲养鲎既可以节约运输成本，减少鲎在运输过程中受到的伤害，增加抽血成功率，还可以避免因潮汛等原因造成捕捉的鲎数量减少从而影响企业按计划生产供应的情况发生。鲎试剂的制备过程要严格执行无菌操作，公司可以建造一个无菌室，在无菌室进行鲎试剂的制备，减少鲎试剂被污染的可能性。企业也应该斥资帮助中国鲎种群的恢复，使得企业有鲎可以采血，利于企业自身的可持续发展。政府部门加强对于公司的监管措施，严格规范鲎试剂公司对于鲎的采血及释放等过程，对于违反规定的公司进行严惩。

4.3　加强科研人员团队建设

鲎试剂产业作为新兴产业，在我国发展缓慢，研究基础薄弱，这与我国从事相关研究的科研人员不足有一定的关系。政府应充分调动科研人员对于鲎试剂的研究热情，大力推动科研工作，客观分析我国鲎试剂产业的研究现状，找出问题的关键，有针对性的进行研究，从而解决问题。如深入研究鲎试验反应动力学机制等技术。为了拓展鲎试剂产业的发展，也应该加强鲎试剂的基础研究，不仅要鼓励科研人员从事鲎试剂的相关研究，政府及相关机构还应加强对鲎试剂相关科研人员的培养，完善鲎试剂生产工艺从而加快鲎试剂相关研究的发展。

4.4　恢复中国鲎种群

中国鲎资源面临枯竭，可通过人工养殖和稚鲎放流等方法促进中国鲎种群恢复。目前，已有很多关于中国鲎人工养殖技术的研究。中国鲎的研究工作可以追溯到20世纪50年代[14]，到了80年代，学者们以中国鲎的人工饲养、人工育苗技术等方面为重点进行了研究[15-17]；90年代，洪水根[18]、廖永岩[19]等进行了进一步研究；近十几年来，更多的学者对中国鲎的人工繁殖技术进行了研究[20-25]，大大推进了中国鲎在我国的研究进程。王骏博[23]研究发现，在适宜的滩涂地区人工养殖或放流幼鲎，幼鲎完全可以在自然区域生长发育。廖永岩和洪水根[24]也认为可以在合适的条件下放流人工育苗养殖成的幼鲎，从而使鲎种群逐渐恢复，有效保护鲎资源。迄今为止，中国鲎人工繁殖技术已经获得成功。依靠这些已有的成果和经验，加快中国鲎的人工增养殖、幼体食性和孵育特性等方面研究的步伐可以为中国鲎资源恢复提供理论基础，从而通过增殖放流方式在一定程度上恢复中国鲎资源。

4.5　提高公众保育意识

人类活动的干扰是中国鲎资源枯竭的一个重要原因。虽然中国鲎是国家二级保护动物，但是很多渔民都不知道鲎的宝贵，甚至对其进行捕杀、食用等违法行为，造成鲎资源的枯竭。所以，提高民众保护鲎的意识是有效保护鲎的一个重要措施，可以大大减少人类活动对鲎造成的伤害。民众的力量是无穷的，我们应该引导广大民众保护鲎，让他们意识到鲎的宝贵，了解到鲎资源濒临灭绝的情况，积极参与到保护鲎的行动中。政府则应加大执法力度，对非法捕捞、贩卖鲎的行为予以打击和严惩，从而促使大众自觉遵守法律。

就鲎试剂产业目前在中国的发展现状而言，相关企业应增强自身责任意识，健全公司管理制度，提高中国鲎的保育意识，以保护中国鲎为前提开展企业制造鲎试剂的工作。政府部门应该规范鲎试剂质量标准，鼓励科研人员从事鲎血液学基础研究和鲎试剂生产工艺改良等工作，从而促进该产业的发展。

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