大鼠脾脏主要结构的发育:2月、2年和3年龄的形态定量研究

李阳友，黄静，郭洋，项涛，吴大鹏，陈丹，杨正伟

(川北医学院，1.动物发育研究室；2.实验动物中心；3.形态定量研究室，四川 南充 637000)

对大鼠重要免疫器官脾脏的发育情况的研究不多。笔者最近采用1日、1月和3～12月龄的同群动物，根据体视学方法定量研究了大鼠脾内各种主要组织结构的总体积，结果表明，3月龄大鼠脾脏已形成各种主要结构，3至12月龄脾脏各种结构的总体积变化较小，脾内红髓、白髓所占体积比例稳定，因此我们得出结论：3月龄前大鼠脾脏生长快速并发育成熟，之后只有一定程度的继续生长[1]。但是，关于2月龄大鼠(相当于大鼠成年前[2])脾脏是否已发育成熟和2～3年龄大鼠(相当于老年后[2])脾脏是否会萎缩的重要问题，我们仍没有答案。为回答这2个问题，我们进行了这项补充完善研究：采用从同一群动物所取的脾脏——以前已取的2月龄大鼠脾脏以及后来所取的2年和3年龄大鼠脾脏，并用同样的体视学方法定量研究这些大鼠脾脏。

1 材料和方法

本文所用动物与方法，基本同笔者以前所述[1]。简要地讲，从一群正常雄性Sprague-Dawley大鼠，分别随机抽选2月龄(59～61 d龄)和24月龄大鼠各9只，36月龄时取实验最后所剩8只大鼠。2月龄动物经腹取脾并用Bouin液浸润固定[1]。2～3年龄动物经心脏先后用250 mL生理盐水和250 mL Bouin液灌注(固定)之后，再进一步浸润固定处理。沿垂直于脾脏长轴的大致方向，从每个脾脏等距随机横向切取2个组织块，用甲基丙烯酸树脂包埋后从每块切取1张10 μm厚的切片，经HE染色后用体视学图像系统观测切片。在切片上等距随机抽选测试视野(视野间距1 000 μm)，视野上叠加2排共4个等距排列的测点，根据测点计数估计各种组织结构(图1)脾内所占体积比例，结合脾脏体积进一步估计脾内结构的总体积。每个脾脏的2张切片上，总共计数了平均218个测点。

2 结果

2月龄大鼠脾脏切片上，仍可见巨核细胞(图1)，但2～3年龄大鼠脾脏里，已没有巨核细胞。

与2月龄大鼠相比，2年龄大鼠脾脏体积的平均增加46%；与2年龄相比，3年龄大鼠脾脏体积有减少(9%)的趋势(表1)。红髓或白髓在脾内所占体积比例(分别为70%～76%、17%～21%)，3个年龄组间无显著差异(单因素方差分析)。

与2月龄大鼠相比：2年龄大鼠脾血窦总体积的平均减少36%，而脾索总体积的平均增加107%；脾小结总体积的平均只增加4%，而动脉周围淋巴鞘和边缘区总体积的平均分别增加62%和92%(表1)。

表1 大鼠脾脏体积和脾内结构总体积(平均值±标准差，mm3)

2月龄组(n=9)2年龄组(n=9)3年龄组(n=8)脾脏 871±301∗1275±3041160±308红髓667±242931±287818±274 脾血窦腔314±152#200±94176±113 脾索353±212∗#731±221643±171白髓149±68231±91239±129 脾小结48±3450±3669±42 动脉周围淋巴鞘47±3776±3184±44 边缘区55±28105±4886±54间质54±16∗#113±44103±33

与2年龄*、3年龄#相比：P≤0.05(秩次单因素方差分析结合Dunn法多重对比)。

3 讨论

前期研究表明，28～35日龄的Sprague-Dawley大鼠脾脏，仍未完全形成脾小结[1,3-4]；至42日龄时，所有脾脏均有脾小结形成[3]；8周时，白髓结构典型[4]。本文的研究表明，2月龄大鼠脾脏已形成各种主要结构。与1月龄同群大鼠[1]相比，2月龄大鼠脾脏体积的平均增加了约260%；而从2月龄至2年龄，脾脏体积的平均只增加了46%，且已达到高峰(从1年龄[1]至2年龄脾脏体积的平均增加了29%)，至3年龄时有开始减少的趋势(3年龄与2年龄相比减少9%)。从2月龄至3年龄，红髓或白髓在脾内所占体积比例的变化不明显。这说明，总的来讲，大鼠脾脏的发育，在2月龄时(成年前或幼年末期)就已成熟，但至2～3年龄(老年后)时仍未见明显萎缩的迹象。

生成血小板的巨核细胞(图1)，是切片上最易辨认的造血细胞。人出生之后脾内即没有巨核细胞，但某些动物(例如啮齿和猫科动物)出生后仍可见[5]。仔细观察前期研究[1]和本文研究的切片，笔者见出生时大鼠脾脏的每张切片上有十来个巨核细胞，1月龄时最多，可见一二十个，2月龄时仍可见几个，3月及以上就完全没有了。这提示，成年前(2月龄及以前)的大鼠脾脏仍有明显的造血功能。

笔者的前期研究[1]和本文的补充研究表明，1月龄大鼠脾血窦腔开始出现红细胞，至2月龄时脾血窦腔的总体积(平均314 mm3)迅速达到高峰，一直维持到3～12月龄(285～332 mm3)，至2～3年龄时大幅下降(176～200 mm3)。如果没有受到固定方法(2～3年龄动物所取标本事先做了灌注固定)的影响，这个结果可能说明2～3年龄动物脾内血流量减少。就是说，尽管脾脏大小在2～3年龄时为最大，但其功能其实可能已减弱。

笔者前期和本文研究也表明，脾小结(生发中心)从2月龄开始出现后，其总体积直至2～3年龄也没有多大增加，且其在脾内所占体积比例一直比较小(约5%以内)。这提示，正常大鼠生长、生存期间，脾小结(生发中心)相关功能(体液免疫)比较稳定，不活跃。

脾脏由非常密集的细胞(淋巴细胞等)构成，其中主要是穿流血液的、由相对较稀疏排列的细胞构成的红髓部分，其在脾内所占体积比例约70%以上。红髓和白髓的辨认相对较易，因此其定量研究结果相对较可靠。白髓内动脉周围淋巴鞘和脾小结帽在切片上的准确区别有一定难度(图1)。为增加准确性，研究中我们实际上把脾小结定义为白髓里面的淡染区域——淋巴小结的生发中心。红髓内脾索和脾血窦的区别难度更大(图1)，尽管我们定义的脾血窦实际上是血窦腔[1]。因此，就各种脾脏组织结构的定量研究而言，笔者前期和本文的研究的可靠性问题仍有值得进一步思考之处。例如，是否有并应采用更好的染色方法。不过，正如笔者已指出的那样[1]，相对于个体差异对定量研究的影响而言，这个问题也许并不那么重要。

[1] 李阳友，黄静，郭洋，等.大鼠脾脏主要结构的发育——从出生至12月龄的形态学定量[J].解剖学报，2017，48(3): 348-352.

[2] 施新猷.医用实验动物学[M].西安:陕西科学技术出版社，1989:388.

[3] Parker GA，Picut CA，Swanson C，etal.Histologic features of postnatal development of immune system organs in the Sprague-Dawley rat[J].Toxicol Pathol，2015，43(6):794-815.

[4] 周宬玥，冯利杰，沈玉君，等.大鼠出生后不同时期脾脏结构发育和浆细胞分化[J].安徽医科大学学报，2012，47(7):796799.

[5] Ross MH，Romrell LJ，Kaye GI.Histology:a Text and Atlas[M].Baltimore: Williams & Wilkins，1995.349.