成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养

陈小燕，樊梦雅，李 慧，蒋易楠，靖 静，张海龙*

(1. 河南大学 医学院 抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室 河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室，河南 开封 475004； 2.郑州大学 基础医学院， 河南 郑州 450001)

心肌微血管是深入心脏内的终末细小分支，在心脏内分布广泛，结构上与其他血管不同，由单层内皮细胞和细胞外基质组成；微血管内皮细胞在表型与功能上均表现出不同于大血管内皮细胞的异质性，且其性质与功能在不同组织器官之间也具有显著差异[1]。

研究表明，心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cell，CMEC)在心脏生理与病理过程(如急性缺血损伤、心肌肥大等)中起着非常重要的作用[2]，是许多心血管疾病或危险因素作用的靶器官[3- 4]。低氧、炎性反应和血栓等均是以微血管内皮细胞受损及功能紊乱为始发因素[5- 7]而发生的。近年来，由于对心血管疾病研究的深入，心肌微血管内皮细胞的分离纯化成为热点。但由于培养难度大，纯化复杂，培养基条件要求高等原因，使得原代细胞的分离难以实现。本研究结合国内外原代细胞培养技术，进行学习和改进，成功分离培养出成年大鼠心肌微血管内皮细胞，为心血管疾病的体外研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级Wistar雄性大鼠[北京维通利华实验技术有限公司，合格证书编号：SCXK(京)2012- 0001]，7～8周龄。饲养于河南大学实验动物中心，所有的动物饲养和实验操作均严格按照本校动物管理委员会要求执行。

1.1.2 主要试剂：戊巴比妥钠和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，索莱宝)；D-Hanks缓冲液、鼠尾胶原、Ⅱ型胶原酶、胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠(Sigma 公司)；胰蛋白酶、DMEM、M199培养基和胎牛血清(Gibco公司)；内皮细胞生长因子(Novoprotein公司)；第Ⅷ因子相关抗原兔抗体(Novusbio公司)；抗大鼠CD31单克隆抗体(Abcam公司)；兔IgG-SABC试剂盒(博士德公司)；鼠Alexa Fluor 594-IgG抗体(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 酶消化法分离成年大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)：按0.2 mL/100 g质量，用 2%戊巴比妥钠腹腔注入麻醉大鼠，固定在手术台上，75%乙醇对大鼠进行消毒灭菌，逐层剪开胸腔，取出心脏，在预冷的PBS中清洗心脏2～3次。然后将心脏置于离体心脏灌流装置上，用预先预冷和充氧的灌流缓冲液CFS (mmol/L：NaCl 134，葡萄糖11，KCl 4，MgSO41.2，Na2HPO41.2，HEPES 10，pH 7.35)冲洗心脏约3～5 min。将心脏取下置于无钙的D-Hanks液中(在冰上操作)，于超净工作台中剪去多余的血管组织、左右心房、右心室及室间隔，将左心室置于75%乙醇中30 s，用镊子将心室的心内外膜剥掉，将组织切成约1 mm3大小的碎块，转移到250 mL锥形瓶中，先用D-Hanks缓冲液清洗1次，随后加入2% Ⅱ型胶原酶于37 ℃ 110 r/min的水浴锅中振荡消化20 min，接着加入等体积0.1%胰蛋白酶，以同样的条件消化20 min，将上清液用70 μm网筛过滤，1 000 r/min离心10 min，重复洗涤细胞1次；然后用完全培养基(20% FBS，2 ng/mL VEGF，870 nmol/L胰岛素，65 nmol/L转铁蛋白，29 nmol/L亚硒酸钠，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，DMEM∶M199为1∶1)重悬并进行细胞计数，接种于包被有100 μg/mL鼠尾胶原的细胞培养皿中，将细胞置于37 ℃ 5% CO2的培养箱中，待培养6 h后更换新鲜培养基，之后每2 d进行换液。待细胞增殖至80%汇合度时进行传代培养。

1.2.2 大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)鉴定

1.2.2.1 细胞形态观察：在显微镜下观察并记录原代培养和传代培养的CMEC形态及增殖特征。

1.2.2.2 细胞增殖曲线绘制：取第3代CMEC进行消化传代，细胞以2.5×104个/孔接种于12孔板中，共接种21个孔，每24 h计数1次，每次3个孔；取20 μL 细胞悬液与等体积的0.2%锥虫蓝染液混合后，取20 μL滴入细胞计数板中，计算活细胞数，绘制增殖曲线。

1.2.2.3 CMEC的分子标志第Ⅷ因子相关抗原和CD31的鉴定：第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定：CMEC接种到加有细胞爬片的12孔板中，接种量为2×105个/孔；在37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h。取出细胞爬片，PBS洗涤3次，每次5 min；4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤3次，每次5 min；0.1% Triton-X 100于4 ℃处理10 min，30 mmol/L甘氨酸室温孵育3 min，PBS洗涤3次，每次5 min；然后用3% BSA室温封闭1 h；抗第Ⅷ因子相关抗原抗体(1∶50)4 ℃孵育过夜。兔IgG-SABC试剂盒进行染色；苏木精染核后，中性树胶封片；显微镜进行观察拍照。

CD31免疫荧光鉴定：操作如上所述，只是不用0.1% Triton-X 100处理；抗CD31抗体(1∶50)4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min；然后用Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠IgG室温避光孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；DAPI染细胞核之后，倒置荧光显微镜进行观察拍照。

1.2.2.4 体外血管形成实验：前1 d，将Matrigel matrix置于4 ℃过夜溶解，实验前2 h将枪头、EP管、细胞培养板等置于4 ℃预冷。取150 μL Matrigel matrix置于24孔板中，铺匀后于37 ℃放置30 min。取第3代细胞进行消化处理，2.5×105个/孔接种于含有Matrigel matrix的培养板中，在37 ℃ 5% CO2条件下进行培养，然后倒置显微镜观察拍照。

2 结果

2.1 CMEC形态特征

经倒置显微镜观察，原代分离的成年大鼠心肌微血管内皮细胞呈圆形悬浮于培养皿中，培养24 h即贴壁增殖，3～4 d后增殖至90%左右汇合(图1A)。当培养密度较低时细胞形成星形或多边形，细胞增殖到90%汇合度时呈铺路石样增殖(图1B)。

2.2 细胞增殖曲线

CMEC的增殖曲线如图2所示。在5次分离实验中，选取其中一次分离结果进行增殖曲线绘制。结果显示，前4 d细胞增殖迅速，呈对数期增殖，第4天之后细胞处于稳定状态，不再迅速增殖。

A.primary passage； B.second generation of cell culture图1 CMEC形态观测Fig 1 Morphological observation of CMEC(×100)

图2 CMEC增殖曲线Fig 2 Proliferation curve of

2.3 CMEC的分子标志

第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学结果(图3A)显示，95%以上的细胞胞质呈棕色，细胞核呈蓝紫色；CD31免疫荧光结果(图3B)显示，细胞胞质和核膜周围有红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。表明分离出的细胞具有内皮细胞的特征。

2.4 体外血管形成实验

CMEC的体外血管形成实验结果(图4)显示，细胞包被在有基质胶的24孔板上，培养2 h即可贴壁、黏附，形成分散的网状及管腔结构(图4A)，4 h时管腔结构更加明显，且结构完整，具有内皮细胞的典型特点(图4B)。

A.Factor Ⅷ; B.CD31图3 CMEC的分子标志Fig 3 Molecular markers of CMEC(×200)

A.2 hours; B.4 hours图4 CMEC的体外血管形成Fig 4 Angiopoiesis of CMEC plated on matrigel(×100)

3 讨论

在以往的研究中，CMEC常用的分离方法有酶消化法和组织贴块法[1,5]等，但是研究中发现，单纯的酶消化法分离的细胞，由于消化时间过长，对细胞的损伤则会加大；而使用组织贴块法则不能很好的排除成纤维细胞及心肌细胞等的污染。因此，本实验在相关研究[5]之后，结合实验室现有条件，对CMEC的分离及培养上，进行了以下几个方面的改进：1)将取出的心脏先用灌流装置进行灌洗，以充分去除血管内的血细胞，使得微血管内没有凝结的血块；于冰上迅速将组织切成1 mm3大小的碎块，减少酶的消化时间，降低细胞因过度消化而造成的损伤；2)将左心室置于75%乙醇中浸泡30 s，然后用镊子完全剥离心内外膜，最大程度上的降低其他细胞及细菌的污染；3)选择合适的培养基：为了满足CMEC所需要的营养物质及增殖条件，本实验采用20% FBS，添加适量的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠，同时加入VEGF，不仅满足CMEC的增殖需求，一定程度上起到了抑制成纤维细胞的作用[8]；4)在对包被液的选择上，尝试了多种试剂，如多聚-L-赖氨酸、鼠尾胶原和明胶等，发现CMEC在100 μg/mL鼠尾胶原包被的培养皿中贴壁较快，因此实验中选取该浓度进行包被。结果显示，CMEC呈铺路石样增殖，且可形成管腔样结构，具有内皮细胞的典型特点[6]；表面标志物鉴定结果表明，CMEC的第Ⅷ因子相关抗原和CD31结果呈阳性[8- 10]；在体外血管形成实验中[11]，血管形成完好，管腔结构完整，综上结果可证明其为心肌微血管内皮细胞。

血管内皮细胞位于血管内壁，细胞间排列紧密形成一层薄膜，为血液的流通提供“管道”，起着物质交换及屏障的作用[12]。有报道在心肌缺血再灌注损伤中，CMEC损伤早于心肌细胞[13]。因此，体外分离培养心肌微血管内皮细胞对进一步研究探讨心脏微环境的生理及病理改变是至关重要的。

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