Hsp90在胰腺癌组织中表达升高及其临床病理意义

刘俊雅，范姝婕，黄 薇，杨 楠，刘雁勇

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 药理学系， 北京 100005)

胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，约90%的胰腺癌为起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤，该病患者的5年生存率不足5%[1- 2]。尽管在过去的20年间人们付出很大努力，其发病率和病死率近年来仍明显上升。预计到2030年，胰腺癌将成为全球第2位癌相关的死因[3]。胰腺癌临床治疗20年来未有大的进展，其发生发展机制有待深入研究。热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是生物界中广泛存在的一类具有高度保守性的蛋白质，当细胞受到不利因素(如缺血、缺氧等)刺激时，它能迅速大量合成，并与客户蛋白结合以调节其结构及功能。作为热休克蛋白家族的重要一员，Hsp90除了参与蛋白质的折叠、运输等过程，其客户蛋白还包括一系列在肿瘤发生发展中起重要作用的肿瘤相关蛋白[4]，影响肿瘤发生发展相关的多种信号传导途径。本研究应用组织芯片的免疫组化方法，分析Hsp90在胰腺癌肿瘤组织及癌旁组织中表达情况，为Hsp90作为胰腺癌潜在的治疗靶标提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例：共包括63例胰腺癌患者组织标本(胰腺癌组织芯片)，本实验获得有效染色样本共62例(编号为D20A0273的标本缺失，本实验未予分析)。其中男36例，女26例，年龄范围在41～85 岁，平均年龄为66岁。参照AJCC第7版制定的标准，去除无临床分期病例，1期5例，2期45例，4期4例；组织病理分级Ⅰ-Ⅱ 10例，Ⅱ 26例，Ⅱ-Ⅲ 26例；去除无TNM分期病例，T1-T2分期9例，T3分期37例；去除无淋巴结转移数病例，淋巴结转移数小于3的16例，转移数大于11的13例。所有病例均无同时患其他恶性肿瘤，患者手术前均未经放、化疗。

1.1.2 主要试剂与材料：胰腺癌组织芯片(上海芯超生物科技有限公司)；兔抗人Hsp90单克隆抗体(Cell Signaling公司)；通用型免疫组化二步法检测试剂盒、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液和DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；其他试剂(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

免疫组化检测Hsp90表达：胰腺癌组织芯片脱蜡，PBS缓冲液冲洗3遍，EDTA抗原修复液在95 ℃进行抗原修复15 min、参照通用型免疫组化二步法检测试剂盒使用说明操作。高倍显微镜下观察Hsp90在各例标本的肿瘤与癌旁组织中表达情况。Hsp90染色阳性判断为镜下组织结构完整、清晰、定位明确、胞质和(或)胞核为棕黄色，染色明显高于背景者。40倍物镜下，在胰腺癌组织芯片上的每个组织点任选3个视野，拍摄照片，用 IPP 6.0软件通过宏处理进行吸光度值分析。测定每个组织点的选择区域(area)的面积及该特定区域的累积吸光度值(IA)，并将这3个视野的累积吸光度值之和除以区域之和，然后计算得出一个代表每个芯片组织点的平均吸光度值(mean optical density=IASUM/area SUM)，以作为该组织点的测量值。该吸光度值的高低与蛋白表达量多少呈正比。实验操作和拍照统计过程的每一步都严格统一控制，以保证各个组织点的操作处理条件相同。最后，统一对其平均吸光度值的平均值与标准差进行统计分析，以分析各个指标之间的相互关系。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 6.0 统计软件进行分析，采用ANOVA或者t检验。

2 结果

2.1 胰腺癌组织芯片免疫组化染色结果

免疫组化染色后的胰腺癌组织芯片阵列排列(图1A)，3例代表性胰腺癌病理标本免疫组化图(图1B)和Hsp90表达量与临床病理指标的关系(图1C)。

2.2 Hsp90在胰腺癌组织中的表达水平与临床病理指标的关系

本实验比较了Hsp90在相应的癌与癌旁组织中的表达与病理分级、临床分期、TNM分期、淋巴结转移数、年龄和性别的关系(表1)。Hsp90在Ⅱ-Ⅲ级胰腺癌组织中表达量明显高于Ⅰ-Ⅱ级(P<0.05)；胰腺癌临床晚期的组织中Hsp90表达水平更高，临床2期胰腺癌组织中的表达量明显高于1期(P<0.05)；T3分期癌组织的Hsp90表达量也高于T1-T2分期(P<0.05)；淋巴结转移数多的胰腺癌组织具有相对较高的Hsp90表达水平(P<0.05)。

A.a-h.1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, i1, i3 and i5-i8 are pancreatic cancer tissues; a-h.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, i2 and i4 are para-carcinoma tissues; B.expressions of Hsp90 in 3 cases of typical pathological specimens; presented in the coHesponding position of figure A;C.a, b.relative expression of Hsp90 in different histologic grades of the pancreatic cancer and para-carcinoma;*P<0.05 compared with Ⅰ-Ⅱ; c, d.relative expression of Hsp90 in different AJCC phases of the pancreatic cancer and para-carcinoma; 1,2,4 represents the AJCC phase 1, phase2, phase3, respectively;*P<0.05 compared with phase 1; e, f.relative expression of Hsp90 in different T phases of the pancreatic cancer and para-carcinoma;*P<0.05 compared with phase T1-T2; g, h.relative expression of Hsp90 in different numbers of lymph nodes;*P<0.05 compared with lymph node metastasis number less than 3; i, j.relative expression of Hsp90 in different ages of the pancreatic cancer and para-carcinoma; k, l.relative expression of Hsp90 in different genders of the pancreatic cancer and para-carcinoma

图1 胰腺癌组织芯片阵列排列示意图、3例代表性病理标本的免疫组化图和胰腺癌组织的Hsp90表达量与临床病理指标的关系

*P<0.05 compared with para-carcinoma.

2.3 Hsp90在胰腺癌组织中的表达水平与患者生存期的关系

胰腺癌组织中Hsp90表达量高的患者生存期略短(图2A)，平均13.8个月，而胰腺癌组织中Hsp90表达量低的患者生存期则为21.5个月。胰腺癌旁组织中Hsp90表达量与患者生存期的关系见图2B。

A.relationship between relative expression of Hsp90 and the patient survival curve in pancreatic cancer tissues; B.relationship between relative expression of Hsp90 and the patient survival curve in para-carcinoma tissues图2 胰腺癌组织的Hsp90表达量与患者生存期的关系Fig 2 Relationship between expression of Hsp90 and the patient survival in pancreatic cancer tissues

3 讨论

热休克蛋白是广泛存在于生物界中具有高度保守性质的多肽类蛋白质，作为伴侣蛋白，它参与靶蛋白的合成、积聚、折叠、装配、运输和降解等过程[5]。Hsps是一个大的蛋白质超家族，根据分子质量的大小可将该家族分为6类：大分子热休克蛋白(100～110 ku)、Hsp90(83～93 ku)、Hsp70(66～78 ku)、Hsp60(60 ku)、Hsp40(40 ku)以及小分子热休克蛋白(15～30 ku)[6]。作为细胞内最重要的分子伴侣之一，Hsp90在许多肿瘤中的表达水平升高，与肿瘤的发生发展关系密切[4]。它在多种肿瘤中的客户端癌基因蛋白的激活、稳定、折叠、聚合、水解和转运等过程中扮演重要角色[7]。总的来说，抑制Hsp90可以通过影响多条信号通路而发挥抗肿瘤作用。近年研究发现，高表达的Hsp90与黑色素瘤、肝癌等预后不良密切相关[8- 9]，表明Hsp90可能作为一种重要的信号元件参与了肿瘤的发生发展进程。

本研究发现63例胰腺癌标本中Hsp90在胰腺癌组织中高表达，而癌旁中的Hsp90表达量低于癌组织。Hsp90在胰腺癌中的过度表达可能是因为肿瘤细胞无限增殖过程需要大量的Hsp90维持稳定，并且肿瘤造成的应激环境也会诱导Hsp90的过度表达。作为一个全新的肿瘤广谱标志物，Hsp90可用来协助探讨相关疾病的发病机理及患者的治疗、预后等，如检测多发性骨髓瘤患者血清中Hsp90的表达情况[10]。自格尔德霉素在 1992年作为第一个Hsp90抑制剂被发现以来[11]，越来越多的其他相关的抑制剂被开发并陆续进入到临床研究阶段，如 Hsp90抑制剂阿螺旋霉素用于晚期实体肿瘤患者的临床Ⅰ期试验并取得了初步成果[12]，这间接证实了Hsp90在多种恶性肿瘤发生发展中的重要作用。本实验结果显示Hsp90的表达与病理分级、临床分期、T分期、淋巴结转移数密切相关，这提示Hsp90作为伴侣蛋白，与胰腺癌的高侵袭、高转移能力具有一定的相关性。总之，本研究通过免疫组化法初步分析了 Hsp90在63例胰腺癌患者标本中的表达情况，这为以后寻找胰腺癌早期诊断、治疗及临床预后评估的分子标志物提供了有价值的参考资料。Hsp90对胰腺癌患者的临床意义有待更深入的研究证实。

[1] Rizzato C, Campa D, Talar-Wojnarowska R,etal. Association of genetic polymorphisms with survival of pancreatic ductal adenocarcinoma patients [J]. Carcinogenesis, 2016, 37: 957- 964.

[2] Vincent A, Herman J, Schulick R,etal. Pancreatic cancer [J]. Lancet, 2011, 378: 607- 620.

[3] Rahib L, Smith BD, Aizenberg R,etal. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States [J]. Cancer Res, 2014, 74: 2913- 2921.

[4] Barrott JJ, Haystead TA. Hsp90, an unlikely ally in the war on cancer [J]. FEBS J, 2013, 280: 1381- 1396.

[5] Zhang L, Fok JH, Davies FE. Heat shock proteins in multiple myeloma [J]. Oncotarget, 2014, 5: 1132- 1148.

[6] Wang X, Chen M, Zhou J,etal. HSP27, 70 and 90, anti-apoptotic proteins, in clinical cancer therapy [J]. Int J Oncol, 2014, 45:18- 30.

[7] Chatterjee S, Bhattacharya S, Socinski MA,etal. HSP90 inhibitors in lung cancer: promise still unfulfilled [J]. Clin Adv Hematol Oncol, 2016, 14: 346- 356.

[8] McCarthy MM, Pick E, Kluger Y,etal. HSP90 as a marker of progression in melanoma [J]. Ann Oncol, 2008, 19: 590- 594.

[9] 杨婧, 曹凯悦, 孙立新, 等. HSP90α和HSP90β在肝癌中共同上调表达[J]. 中国肿瘤, 2016, 25: 391- 394.

[10] 邹彬镔, 郭宁红, 石庆之,等. 多发性骨髓瘤患者血浆HSP90的表达及其临床意义[J]. 中国实验血液学杂志, 2014, 22: 1326- 1330.

[11] Whitesell L, Shifrin SD, Schwab G,etal. Benzoquin-onoid ansamycins possess selective tumoricidal activity unrelated to src kinase inhibition[J]. Cancer Res, 1992, 52: 1721- 1728.

[12] Pacey S, Wilson RH, Walton M,etal. A phase I study of the heat shock protein 90 inhibitor alvespimycin (17-DMAG) given intravenously to patients with advanced solid tumors[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17: 1561- 1570.