逆神经走行方向探寻并摘取大鼠背根神经节的改进方法

马理元，姜劲挺,*，张伦广，李祥雨，郑吉元，徐 欣，王强强

(1.甘肃中医药大学，兰州 730000； 2.甘肃中医药大学附属医院，兰州 730000； 3.兰州大学第二医院，兰州 730000)

背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)作为感觉传入的第一级换能神经元的集中位置[1-2]，在外周信号的产生和传导过程中有着至关重要的作用，是神经、疼痛、骨科等多领域的研究对象，因此获取完好无损的DRG成为相关研究的必要前提，但由于其特殊的解剖位置：体积小、位置深、被脊椎椎间孔所嵌顿，同时周围有大量结缔组织包绕[3]，给相关研究人员获取DRG带来一定难度。为短时间获得完好DRG，本研究通过比较两种DRG的取材方法，证明逆神经走行方向探寻并摘取DRG这一新方法的高效性和实用性，期为背根神经节研究提供保障。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体重(200±10) g，由甘肃中医药大学实验中心提供[SCXK (甘) 2015-0002]，[SYXK (甘) 2015-0005]。本实验福利伦理审批IACUC号：2017-095。实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

水合氯醛，4%多聚甲醛；剃毛器，手术刀，直头止血钳，弯头止血钳，手术剪，咬骨钳，眼科剪，眼科镊。

1.3 实验方法

1.3.1 术前麻醉

大鼠术前不限制食水，10%水合氯醛按0.3 mL/kg腹腔注射。

1.3.2 传统方法取材

待大鼠麻醉成功后，将其俯卧位固定于平木板上，剃毛器剔除腰部毛发，用碘伏棉球擦拭手术区，在腰部正中线和髂后上棘连线处作一纵行切口，切口向上下方向各延长2.5～3 cm，逐层切开筋膜至肌肉层，用止血钳轻提起棘突旁的肌肉，用手术刀作一纵行小切口，用弯钳钝性分离脊柱两旁的肌肉，至棘突、乳状突、横突充分暴露，暴露范围根据所需DRG决定，剪掉棘突，用咬骨钳自棘突根部蚕食性地向椎体两旁咬去椎板，使脊髓后侧、外侧充分暴露后(如图1A)，用眼科镊将脊髓从上端缓慢、轻巧地提起后即可见到脊神经后根分支和其在椎体的出口，咬开椎间孔后即可看到淡黄色、卵圆形的DRG，长约1.5 mm，充分暴露后，用眼科剪剪断其两端的神经，将其置于盛有4%多聚甲醛溶液的离心管中。记录每只大鼠从L3～5节段取出的完好DRG数目及其所消耗时间。

1.3.3 新方法取材

同上麻醉后切开皮肤、筋膜，暴露肌肉，分离脊柱两旁肌肉，暴露脊柱乳状突、横突，同时密切观察横突旁肌肉中走行的神经，并将其分离出来(如图1B)，逆神经走行方向，从下向上寻得神经从椎体的出口，即横突后缘处，用咬骨钳将出口上下的骨质咬去，即可暴露DRG，用眼科镊将之前暴露的神经镊起，轻缓地向后外方用力，即可拉出DRG，减去其两端的神经，将其置于盛有4%多聚甲醛溶液的离心管中。记录每只大鼠从L3～5节段取出的完好DRG数目及其所消耗时间。

注：A：传统方法摘取大鼠背根神经节；B：坐骨神经走行。① 脊髓；② 背根神经节；③ 坐骨神经。图1 大鼠神经解剖图Note. A: DRG extracted with the traditional method. B: Sciatic nerve running direction. ① Spinal cord; ② DRG; ③ Sciatic nerve.Fig.1 Anatomy of the rat nerves

1.3.4 石蜡切片及HE染色步骤

(1)取新鲜的DRG于4%多聚甲醛液固定24 h后，流水冲12 h。

(2)依次用75%～100%的乙醇连续脱水，二甲苯透明3次，浸入60℃石蜡中进行包埋；石蜡包埋的标本连续切片4张，厚度为4 μm，室温干燥。背根神经节行苏木素-伊红染色(HE染色)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 DRG数目和耗时差异

两种方法均可将L3～5的DRG取出，逆神经走行方向探寻并摘取DRG这一新方法相对于传统方法更为高效，且其取得的DRG形态更为完整，数目也明显增多(P< 0.05)。见表1。

Tab.1Comparison of the traditional method and the new method for DRG extracting

方法Methods大鼠数量Numberofrats每只大鼠取得的完整DRG数量NumberofintactDRGsextractedfromeachrat摘取每个DRG耗时(min)TimeconsumptionforextractionofaDRG传统方法Traditionalmethod15308±131558±121新方法Newmethod15429±108∗169±091∗

注：与传统方法比较，*P< 0.05。

Note. Compared with the traditional method,*P< 0.05.

2.2 形态差异

正常大鼠经两种方法取得DRG经石蜡包埋、切片、HE染色后如图2：传统方法所取得的DRG(图2 A)边缘毛糙不清，着色不均，可能是由于取材时对DRG结缔组织分离不彻底和挤压性损伤所导致。新方法所取得的DRG(图2B)组织光滑、着色均匀、结构清晰。

注：A：传统方法所取得的DRG；B：新方法所取得的DRG。图2 正常大鼠背根神经节石蜡切片(HE，× 40)Note. A: DRG obtained by the traditional method. B: DRG obtained by the new method.Fig.2 Histology of normal rat DRGs. HE staining

3 讨论

位于外周神经系统的DRG作为感觉信息传导通路的第一站，位于其内的中、小型神经元与痛觉信息的感受和传递有着极为密切的关系，所以又将DRG形象地称为痛觉感受器或伤害性感受器[4]。相关研究表明DRG在损伤或炎症条件下因阈值下降、适应性减弱而处于兴奋状态，这是其产生慢性疼痛的根本原因[5]。长期积累的慢性疼痛信号则会通过中枢神经元形成中枢敏化，中枢敏化又会造成痛觉过敏，如此形成恶性循环[6]。因此只有深入研究DRG，才有望从根源上解决慢性疼痛。综上，高效的DRG取材方法的探寻是极为必要的。

目前背根神经节的取材方法有传统的单独摘取法[7]、连同脊髓同时提取法[7]、直接固定打开椎管取材法[8]，以上方法的操作中均需打开椎板、暴露脊髓后才能分离神经根及背根神经节，但椎板质硬、脊髓易碎的特点导致采用传统方法摘取DRG具有难度大、耗时长、易挤压损伤DRG的弊病，而本文研究采用逆神经走行方向探寻并摘取DRG的新方法，先分离神经，然后沿神经从下向上寻得神经从椎体的出口，暴露并摘取DRG，避开打开椎板、暴露脊髓的环节，相对传统取材方法不仅在取得的DRG数量上有所增加，且缩短了取材时间，同时弥补了传统取材方法取得的DRG结缔组织剔除不彻底、易挤压损伤DRG等不足之处，值得在相关实验中推广使用。

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