瑞舒伐他汀对胶质瘤U87细胞迁移、侵袭的抑制作用

刘 明，刘熙鹏

(河北北方学院附属第一医院神经外科，河北 张家口 075061)

1 材料和方法

1.1 细胞株

胶质瘤细胞U87购于中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

瑞舒伐他汀钙购于浙江京新药业有限公司，溶解于二甲基亚砜(DMSO)，并制成浓度为2×103μmol/L的瑞舒伐他汀母液，并根据实验要求利用培养基进行稀释；兔抗人MMP2、MMP9、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、β-catenin及GAPDH多克隆抗体均购于美国Abcam公司；胎牛血清、DMEM培养基、Transwell小室均购于美国Gibco公司；BCA蛋白测定试剂盒、CCK-8试剂盒均购于南京凯基生物技术有限公司。

DYCZ-425D型双垂直电泳仪、DYCZ-40D型转印电泳仪均购于北京六一仪器厂；GelDoc XR System凝胶成像系统购于美国伯乐公司；168-1000XC型酶标仪均购于美国BD公司；AF6000型荧光显微镜购于德国莱卡公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞活力

将5×103个U87细胞接种到96孔板，培养24 h，加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀作用24、48、72 h，加入CCK-8试剂，继续孵育4 h后，利用酶标仪检测波长570 nm处的OD值，每组平行3个复孔。

1.3.2 划痕实验检测细胞迁移能力

将8×103个U87细胞接种到6孔板，培养24 h后，于6孔板底部用记号笔划线，再用200 μL的枪头对6孔板内的细胞进行划痕，接着用PBS洗去脱落下来的细胞，加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀培养48 h，于倒置显微镜下进行拍照并每孔选取4个视野进行划痕距离的记录。

1.3.3 Transwell法检测细胞侵袭能力

实验前将Matrigel胶均匀地平铺于Transwell小室微膜上，备用。将8×103个U87细胞接种到6孔板培养24 h后，加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀培养48 h后，消化细胞并制成单悬液，接种到Transwell上室，而下室仅加入DMEM培养基，48 h后，将Transwell小室取出来，用多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，并于倒置显微镜下观察，对5个视野中的细胞数目进行计数，并取平均值，即为细胞的侵袭数目。

根据对泰煤家园的调查与研究，利用优势理论和参与式发展理论，实现群策群力、共享共治的目标。最终落脚到民生民情关怀上，以此重唤居民自豪感，重拾工人自信心。

1.3.4 Western blot检测细胞中MMP2、MMP9及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达

收集细胞并裂解，离心收获上清液即是总蛋白。根据BCA试剂盒说明书测定总蛋白浓度，制作浓缩胶和分离胶，蛋白上样，进行十二烷基磺酸钠凝胶电泳，湿法转膜。2%的BSA室温下孵育1 h，一抗溶液(兔MMP2、MMP9、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、β-catenin及GAPDH多克隆抗体，稀释度为1∶100)4℃过夜孵育，次日室温条件下二抗溶液孵育1～2 h，在凝胶成像系统中曝光。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 瑞舒伐他汀对U87细胞活力的影响

与对照组比较，随着作用时间延长，5 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组细胞活力逐渐降低(P< 0.01)，且随着给药浓度增加，细胞活力也逐渐降低(P< 0.01)，见表1。

2.2 瑞舒伐他汀对U87细胞迁移及侵袭能力的影响

与对照组比较，5 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组细胞迁移及侵袭能力显著降低(P< 0.01)，见图1、图2及表2。

2.3 瑞舒伐他汀对U87细胞中MMP2及MMP9表达的影响

与对照组比较，5 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组MMP2及MMP9表达量显著下调(P< 0.01)，见图3。

2.4 瑞舒伐他汀对U87细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，5 μmol/L组、10 μmol/L组、20 μmol/L组中Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin表达量显著下调(P< 0.01)，见图4。

3 讨论

瑞舒伐他汀是20世纪80年代合成得到的一种新型他汀类降脂药物，能够抑制内皮素、NO的合成与释放，减少自由基生成，能够改善动脉内皮功能，能够防治动脉粥样硬化斑块的产生，最终减少心血管疾病的发生[4-5]。瑞舒伐他汀对肝细胞具有很强的亲和力，且与其它药物之间作用小，是目前常用的心脑血管二级预防药物[4-5]，且近些年来研究还发现瑞舒伐他汀对乳腺癌、肺癌、乳头状甲状腺癌、胰腺癌及肝癌等肿瘤具有显著疗效[9-10]，同时研究还发现瑞舒伐他汀对胶质瘤细胞具有显著毒性[6]，但具体作用机制未知。另外研究报道证实瑞舒伐他汀能够显著抑制高半胱氨酸及PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞的迁移[7-8]，提示瑞舒伐他汀可能对胶质瘤细胞迁移及侵袭具有抑制作用，因此本研究对此展开了探讨。

Tab.1Effect of rosuvastatin on the viability of U87 cells

组别Groups24h48h72h对照组Controlgroup0486±00500612±00610728±00735μmol/L组5μmol/Lgroup0442±0044∗∗0520±0052∗∗0542±0054∗∗10μmol/L组10μmol/Lgroup0396±0040∗∗0443±0044∗∗0451±0045∗∗20μmol/L组20μmol/Lgroup0336±0030∗∗0351±0035∗∗0358±0036∗∗

注：与对照组比较，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：对照组；B：5 μmol/L组；C：10 μmol/L组；D：20 μmol/L组。图1 瑞舒伐他汀对U87细胞迁移能力的影响(× 200)Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group.Fig.1 Effect of rosuvastatin on the migration ability of U87 cells

注：A：对照组；B：5 μmol/L组；C：10 μmol/L组；D：20 μmol/L组。图2 瑞舒伐他汀对U87细胞侵袭能力的影响(× 200)Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group.Fig.2 Effect of rosuvastatin on the invasion ability of U87 cells

Tab.2Effect of rosuvastatin on the migration and invasion abilities of U87 cells

组别Groups迁移距离(μm)Migrationdistance侵袭数目Numberofmigratedcells对照组Controlgroup2031±23115968±15．975μmol/L组5μmol/Lgroup1557±105∗∗9854±9．85∗∗10μmol/L组10μmol/Lgroup834±084∗∗7146±7．14∗∗20μmol/L组20μmol/Lgroup351±035∗∗4238±4．23∗∗

注：与对照组比较，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：对照组；B：5 μmol/L组；C：10 μmol/L组；D：20 μmol/L组。与对照组比较，**P< 0.01。图3 瑞舒伐他汀对U87细胞中MMP2及MMP9表达的影响Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.3 Effect of rosuvastatin on the expression of MMP2 and MMP9 in U87 cells

注：A：对照组；B：5 μmol/L组；C：10 μmol/L组；D：20 μmol/L组。与对照组比较，**P< 0.01。图4 瑞舒伐他汀对U87细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.4 Effect of rosuvastatin on the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins in U87 cells

本研究首先采用CCK-8法检测瑞舒伐他汀对胶质瘤细胞U87活力的影响，结果表明瑞舒伐他汀能显著降低U87细胞活力，并具有剂量及时间依赖性，与Tapia-Pérez等[6]的研究一致。胶质瘤细胞的快速增殖、侵袭是患者术后失败的主要原因之一[11]。而细胞外基质的降解为肿瘤细胞快速进出细胞提供足够空间，这一过程主要由蛋白水解酶MMPs介导。MMPs是一类依赖于Zn2+的蛋白水解酶，主要分为四类，其中明胶酶MMP2和MMP9不仅能够降解基膜主要成分IV胶原、层连蛋白等，还能够诱导血管新生，促进癌细胞浸润扩散。目前研究证实高表达的MMP2、MMP9与胶质瘤的高侵袭性正相关，且患者生存结果差[12]。说明通过降低MMP2和MMP9表达，能够显著降低胶质瘤侵袭并提高患者生存能力。而且Gan等[7]研究表明瑞舒伐他汀能够通过下调MMP2、MMP9表达进而抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移，Shi等[8]研究表明瑞舒伐他汀能够通过下调MMP2表达进而抑制高半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞迁移，提示瑞舒伐他汀对MMP2及MMP9表达具有调控作用，所以本研究利用Western blot检测瑞舒伐他汀对U87细胞中MMP2和MMP9表达的影响，结果表明瑞舒伐他汀能显著降低MMP2和MMP9表达，从而抑制细胞的迁移与侵袭。

胶质瘤的高侵袭性受多种信号通路的调控，Wnt信号通路就是最为重要的一种[13-14]。Wnt属于原癌基因，包括20种亚族，不仅参与胚胎的发育过程，还在炎症、肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。Wnt通过四条信号通路将外界刺激传递到靶细胞，并使细胞发生相应的应答反应。其中Wnt/β-catenin信号通路是其经典通路，β-catenin是此通路的核心分子，正常生理条件下，β-catenin处于细胞质中，与Axin、APC及GSK-3β等形成复合物，当Wnt被激活后，Wnt与Frizzled形成复合物激活Axin，使β-catenin从复合物中解离出来并在细胞浆中积聚，最后进入细胞核内，与TCL/LEF转录因子结合，刺激MMPs、CyclinD1、c-myc等多种靶基因的转录与表达[15]。研究表明Wnt/β-catenin信号通路在胶质瘤中高度激活并上调(包括Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin)，并与胶质瘤的高侵袭性密切相关[13-14]。因此抑制Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达，有助于降低胶质瘤的侵袭性。所以本研究进一步探讨瑞舒伐他汀对胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响，结果表明瑞舒伐他汀能显著抑制U87细胞中Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin表达，从而下调MMP2及MMP9表达，最终抑制细胞的迁移与侵袭。

综上所述，5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀能显著降低U87细胞活力，抑制细胞迁移与侵袭能力，并下调MMP2及MMP9表达，此过程与阻断Wnt/β-catenin信号通路有关。在今后的实验研究中，本课题组将会深入探索瑞舒伐他汀对人体胶质瘤的作用机制，期望研究成果为临床应用提供理论与实验基础，并为胶质瘤的综合治疗提供新的选择。

[1] 林婷婷, 李钢. 脑胶质瘤的综合临床治疗的研究进展 [J]. 中国临床神经外科杂志, 2013, 18(5): 316-319.

[2] 曾实, 许民辉, 徐伦山, 等. 脑胶质瘤诊疗的研究进展 [J]. 医学综述, 2017, 23(24): 4835-4839.

[3] Ryken TC, Parney I, Buatti J, et al. The role of radiotherapy in the management of patients with diffuse low grade glioma: a systematic review and evidence-based clinical practice guideline [J]. J Neurooncol, 2015, 125(3): 551-583.

[4] 余勋. 瑞舒伐他汀防治心血管疾病的研究进展 [J]. 中国药房, 2016, 27(29): 4174-4176.

[5] Adams SP, Sekhon SS, Wright JM. Rosuvastatin for lowering lipids. [J]. Cochrane Db Syst Rev, 2014(11): CD010254.

[6] Tapia-Pérez JH, Kirches E, Mawrin C, et al. Cytotoxic effect of different statins and thiazolidinediones on malignant glioma cells [J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2011, 67(5): 1193-1201.

[7] Gan J, Li P, Wang Z, et al. Rosuvastatin suppresses platelet-derived growth factor-BB-induced vascular smooth muscle cell proliferation and migration via the MAPK signaling pathway [J]. Exp Ther Med, 2013, 6(4): 899-903.

[8] Shi YF, Chi JF, Tang WL, et al. Effects of rosuvastatin on the production and activation of matrix metalloproteinase-2 and migration of cultured rat vascular smooth muscle cells induced by homocysteine [J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2013, 14(8): 696-704.

[10] Yokohama K, Fukunishi S, Ii M, et al. Rosuvastatin as a potential preventive drug for the development of hepatocellular carcinoma associated with non-alcoholic fatty liver disease in mice [J]. Int J Mol Med, 2016, 38(5): 1499-1506.

[11] 刘旭杰, 蒲军. 胶质瘤侵袭性研究相关进展 [J]. 现代肿瘤医学, 2016, 24(17): 2823-2826.

[12] Tabouret E, Boudouresque F, Farina P, et al. MMP2 and MMP9 as candidate biomarkers to monitor bevacizumab therapy in high-grade glioma [J]. Neuro Oncol, 2015, 17(8): 1174-1176.

[13] Zhang K, Zhang J, Han L, et al. Wnt/beta-catenin signaling in glioma [J]. J Neuroimmune Pharmacol, 2012, 7(4): 740-749.

[14] 卢文卿, 刘洁. Wnt5a与神经胶质瘤关系的研究进展 [J]. 临床神经病学杂志, 2017, 30(2): 147-148.

[15] 张嘉美, 赵宁, 吴晓玲, 等. Wnt/β-catenin信号通路对细胞凋亡和坏死的调控研究进展 [J]. 中国细胞生物学学报, 2015, 37(9): 1309-1316.