一项新型封闭穿刺技术应用于骨肿瘤穿刺活检中的价值

马雅昌，郭 健，朱雅文，杨朝昕，邱宇辰，金 宇

(1.承德医学院 研究生院，河北 承德 067000；2.承德医学院附属医院 创伤骨科,河北 承德 067000)

骨肿瘤占全身肿瘤的0.2%，其中80%发生于四肢长骨。至今骨肿瘤的诊断是仍是骨科难题，虽然目前的影像学技术能初步鉴别骨肿瘤的良恶性，但却很难明确诊断。穿刺活组织检查技术是目前诊断肿瘤疾病的重要手段，在骨科也有广泛应用，对临床治疗前判断肿瘤组织的良恶性、组织分型及分化程度都有无可替代的作用，现阶段通过穿刺活检能够对骨肿瘤做出病理学定性及组织学分型，对于治疗方案的选择具有重大意义[1]。不恰当穿刺活检会给肿瘤患者带来不良后果，正确活检则需要放射线科、骨科、病理科三方配合操作后做出最后诊断。目前的肿瘤穿刺包括骨肿瘤在内的穿刺活检技术不能解决穿刺孔出血、瘤组织穿刺后局部转移等不足之处，因为穿刺损伤了肿瘤的包膜及血管，开放了瘤细胞漏出通路，瘤细胞在针道中扩散引起肿瘤细胞释放，而产生包膜外肿瘤生长的危险[2]。除穿刺活检器械本身局限外，正确用穿刺器械也同样重要，如果活检方法不正确，也会造成肿瘤对血管、神经束等组织污染，导致肿瘤切除不净，而导致治疗失败[3]，因此，我科在总结大量临床骨肿瘤穿刺经验的基础上，发明了一种新型的穿刺骨组织的装置和穿刺后封闭穿刺骨孔的器械，本文拟通过兔VX2骨肿瘤动物模型考察这一新的穿刺技术装置能否改善传统穿刺活检的不足，降低穿刺引起的肿瘤局部扩散。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验于2016 年5～11月在承德医学院基础所完成。实验动物为清洁级，新西兰大白兔36只，体质量1.5～2.0 kg，购于天津津南区春乐实验动物养殖场，雌雄不限，进行隔笼喂养，实验前饲养1周。本实验对动物的处理符合中国《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂材料与仪器 RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒、VEGF扩增试剂盒(普洛麦格公司)；VEGF引物设计与合成(上海生工公司)；闭穿刺针、高分子封闭栓(专利号:201310050606.1 见图1) ；LOGIQ9超声诊断扫描仪(美国GE公司) ；TG16G高速离心机(天津广丰公司)；PCR 扩增仪(德国 Eppendorf公司)；紫外分光光度计(德国 Eppendorf 公司)；Lightcycler 荧光定量PCR 仪(Roche公司)；兔VX2 肿瘤组织由广州吉妮欧生物试剂公司提供。

图1 新型穿刺技术装置的封堵栓及穿刺针

1.3 骨肿瘤穿刺及封堵装置结构 本文穿刺及封堵骨孔的器械包括套管、密封栓及密封栓的推进器。自主创新的密封栓由高分子聚合物材料制成环状翅片、成对凸起或成对倒钩，凸起或倒钩的间距及环状翅片的直径均大于套管孔的内径，可自膨胀且在膨胀状态下直径明确大于管体通道的直径。

通道套管穿入骨组织、拔出通道针芯使骨与体外相通、取出骨组织后再次通过通道套管、封闭栓封堵穿刺孔、拔出套管。图2 新型穿刺技术操作过程示意图

1.4 方法

1.4.1 动物模型建立与穿刺操作 首先制备兔VX2骨肿瘤模型，36只兔于实验前均禁食12 h，在无菌条件下将试验用鳞癌瘤组织块剪切成小于0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的瘤组织块，加入PBS液制成瘤混悬液。36只兔用3%的戊巴比妥钠按1 mL/kg给予耳缘静脉注射进行麻醉，成功后，将所有实验兔左胫骨上段去毛消毒，在兔胫骨干骺端用直径为1 mm克氏针钻骨至骨髓腔，将鳞癌瘤混悬液注入到骨髓腔内，用医用骨蜡仔细封口后冲洗缝合。右侧则不予任何处理。VX2瘤组织植入成功后进行标准饲养。于1、2、3、4周后，将实验兔进行胫骨X线检查，4周后的36只实验兔胫骨X线显示胫骨骨质明显破坏、髓腔密度不等，骨皮质未见明显受累，确定造模成功，此阶段实验兔适宜行肿瘤穿刺操作(见图3)。对实验给予3%戊巴比妥钠(剂量同前)耳缘静脉注射，麻醉成功后于兔的左侧胫骨结节表面剃毛，固定在手术台，消毒铺单。将36只造模成功的兔按随机数字表法分为VX2实验组和VX2对照组，分组后对两组模型兔的左侧小腿骨肿瘤的区域进行穿刺操作，VX2实验组兔采用新型封闭穿刺装置及技术穿刺，并在穿刺后用高分子封堵栓对胫骨VX2肿瘤穿刺孔进行封堵，缝合(见图4)。VX2对照组兔采用传统穿刺活检装置进行穿刺操作，穿刺后穿刺孔不进行封堵，仅采用按压方式止血。两组兔穿刺过程中均1次成功并获取肿瘤组织。术后预防性使用抗生素。

4周可见胫骨骨质明显破坏、髓腔密度不等，可见骨皮质未见明显受累，确定造模成功，证明此阶段适宜行穿刺活检操作。图3 造模兔在瘤细胞液植入后侧位片

1.4.2 B超检查穿刺孔出血情况 穿刺1 h后，对所有兔穿刺侧胫骨进行B超检查，观察封闭栓是否有脱落及出血和血肿形成情况。

1.4.3 总RNA提取 根据Trizol试剂盒说明书行总RNA提取。用小号骨科刮匙刮取实验兔穿刺通道及周围组织，取穿刺通道及周围组织50～100 mg于含有1 mLTrizol匀浆管中，上均浆仪中匀浆20 s后迅速置于冰上；在超净台中温育5 min后以12 000 r/min离心10 min；吸取上清液至新的1.5 mL离心管中，加200 μL氯仿，摇匀后静置2 min，12 000 r/min离心10 min；取上清液至新的1.5 mL离心管中，加600 μL异丙醇，混匀后静置15 min；12 000 r/min离心15 min，弃掉上清液后加1 mL75%无水乙醇洗沉淀，室温，12 000 r/min离心5 min，弃掉上清液；加1 mL无水乙醇，洗沉淀，室温，12 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，干燥10 min，室温；加40 μL DEPC水溶解RNA；置-80 ℃超低温冰箱。

1.4.4 检测总RNA的浓度及纯度 使用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。使用DECP水调零后加1 μL RNA液行总RNA连续3次浓度测定，并记录数值和均值。判断RNA纯度(A260nm/A280nm)，比值若在1.8～2.0时，说明所测RNA纯度达标。计算RNA样本溶度(计算公式:A260nm×稀释倍数×40 μg/mL)。

1.4.5 逆转录 根据Promega公司试剂说明书进行。按要求比例配制25 μL体系(RNA-Primer Mix：12 μL、5×RT Reaction Buffer：5 μL、25 mM dNTPs：1 μL、25 U/μL RNase Inhibitor：1 μL、200 U/μL M-MLV Rtase：1 μL、RT引物：1 μL、ddH2O(DNase-free)：3 μL、随机引物：1 μL的用于定量PCR反应的cDNA合成反应液。逆转录反应条件:37 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，5 min；置于-20 ℃保存。

1.4.6 qPCR检测穿刺穿刺通道及周围组织VEGFmRNA表达量 按要求比例配制25 μL体系(SYBRGreen Mix:12.5 μL、上游引物F：0.5 μL、下游通用引物：0.5 μL、ddH2O：9.5 μL、cDNA模板：2 μL)的定量PCR反应液。反应条件：95℃预变性2 min， 95 ℃变性10 s，退火60 ℃15 s，72 ℃延伸50 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。VEGF上游引物：5′-T C A C C T A C T G T C A T C T G C T T C C -3′,下游引物：5′-G G C T A C T A C T T C G T C CA C T C T T-3′。实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，采用2-ΔΔCt对目标基因VEGF的mRNA表达进行定量)。

1.4.7 穿刺通道及周围组织病理学检测 穿刺操作2周后，对肿瘤穿刺通道及肿瘤穿刺孔附近组织进行取样浸泡于4%甲醛溶液中进行固定石蜡包埋，切片后进行苏木素伊红染色。将肿瘤穿刺通道及肿瘤穿刺孔附近组织的病理学切片诊断结果进行对比，分析出VX2实验组与对照组瘤细胞的扩散转移情况。

2 结果

2.1 穿刺孔周围血肿情况 穿刺1 h后，B超示VX2实验组封闭栓均无脱落，其中有2只(11.1%)穿刺孔检测到出血情况，其余的16只穿刺孔周围未见出血及血肿；对照组中有15只(83.3%)在穿刺孔周围检测到出血情况(见图4)，两组出血率比较差异有统计学意义(见表1)，证明VX2实验组穿刺后引起的出血及血肿率明显降低。

A： VX2对照组穿刺孔周围检测到不均匀的回声区域，信号杂乱，区域内可见片状较高回声；B：VX2实验组肌肉组织回声均匀，穿刺孔周边层次清晰，无血液渗漏情况。图4 多普勒超声检测穿刺孔周围出血情况

表1超声技术检测两组穿刺孔出血及血肿形成情况

组别例数穿刺孔血肿形成有无P对照18153实验18216<0.01合计361719

2.2 穿刺通道及周围组织的VEGF mRNA表达 经qRT-PCR检测，两组标本VEGF mRNA的相对表达量(2-△△t)均呈正态分布，且方差齐，故采用独立样本t检验，统计数据如下(见表2及图5)

表2穿刺通道组织VEGF mRNA的相对表达量(2-△△t)统计(n=18)

组别 x±stPVX2对照2.997±1.4543.348<0.01VX2实验1.670±0.768

**：与对照组比较，P<0.05。图5 穿刺通道周围组织VEGF mRNA的相对表达量

2.3 肿瘤扩散转移情况比较 VX2实验组穿刺通道周围软组织中2只(11.1%)发现瘤细胞，余样本均示正常，未发现瘤细胞(见图6A)。VX2对照组中12只(75.0% ) 发现瘤细胞(见图6B) ，两组肿瘤细胞扩散转移率比较差异有统计学意义(P<0.05) ，VX2实验组肿瘤细胞扩散率较对照组低。

A:VX2 实验组病理图：病理切片可见正常的结蹄组织，肌纤维切面可见明暗相间的横纹(箭头所指)，核多并位于细胞周边、软骨基质有大量规则弹性纤维，其病理诊断为正常骨骼肌组织； B:VX2 对照组穿刺后病理图：病理切片可见骨周围软组织破坏显示不清，有异性肿瘤细胞浸润、瘤细胞巢状排列、癌巢见角化珠形成(箭头所指)，其病理诊断为鳞癌； 苏木素伊红染色，A、B × 40)。图6 VX2实验组与VX2对照组病理学图片

3 讨论

3.1 现阶段临床常用穿刺活检技术 骨及软组织肿瘤是严重威胁人类健康及生命的一种疾病，近年来骨及软组织肿瘤发病率呈现明显的上升趋势和年轻化趋势，其正确的诊断对该病的治疗和预后有着重大影响。在外科的诊断中，骨骼疾病首选的检查方法仍然是X线片，多数情况下，X线片检查可以较清晰的显示骨骼结构、病变的大体范围及骨质的破坏情况[4-5]，其对骨骼的内部结构及软组织显像不清的情况可进一步选择 CT、MRI等影像学检查[6]，但是在骨肿瘤诊断过程中穿刺活检操作仍然是骨肿瘤诊断的金标准[7]。穿刺活检作为肿瘤的常用检查技术，具有操作简便、出血少感染机会小、不影响二次手术等优点。现阶段临床常用到的骨肿瘤穿刺活检技术：①切开活检：该活检方法的优点是穿刺取得的组织量大，诊断正确率最高，缺点是易引起出血感染和局部瘤组织污染[8]。②套管穿刺：此穿刺方法能够取出一定量的肿瘤组织，较切开活检要少，在肿瘤良恶性、肿瘤分期诊断方面应用价值很高，是临床广为应用的穿刺法[9],其同样不能避免瘤细胞的污染。本研究中使用到的套管针，属于空芯针类穿刺法的范畴，研究已证实空芯针穿刺法与切开法准确率相近，且空芯针穿刺法引起的并发症如出血感染及瘤细胞扩散率均明显的低于切开活检法[10]。Kasraeian等研究证明套管针穿刺法准确率高于细针穿刺法[11]。③细针活检法：该法在诊断肿瘤诊断准确率能达到90%～95%，但因其所得组织量小，在确诊肿瘤性质分期方面存在缺陷。另外骨皮质硬，细针易出现断针情况，因此在骨肿瘤中应用很少。④各种穿刺法与影像学的结合：随着影像学技术的发展，其在肿瘤穿刺活检方面也体现出越来越大的价值，各种穿刺技术在B超等技术引导下，穿刺技术逐步更新，明显提高了穿刺取出肿瘤率，能在穿刺过程中尽可能的避开血管神经等重要结构，降低了并发症。

3.2 肿瘤穿刺并发症及对策 骨肿瘤活检并发症主要包括穿刺通道感染、穿刺孔及通道的出血、瘤细胞污染。虽然临床医师尽了各种努力，但穿刺活检的并发症难以避免。穿刺活检时，穿刺过程应尽可能避免破坏重要神经血管及有包膜的结构，另外活检方式的选择要考虑到预期的手术和治疗方案，不合理的活检方式可能会导致肿瘤细胞的播散及神经血管的损伤，有经验的骨肿瘤取材医师进行活检操作可明显提高穿刺活检的取出率和准确率。穿刺引起出血是穿刺活检主要并发症之一，多数出血为少量的，但也需警惕大出血的可能[12]。

本研究中实验组穿刺过程中隔绝了穿刺通道与周围正常的组织，使硬质骨肿瘤与外界形成了直接通道后再用取样针通道中提取肿瘤组织，取出肿瘤组织的全过程都不与正常组织接触，在取样结束后用高分子材料封堵栓确切封堵穿刺骨孔。多项研究证明血管内皮生长因子可以促进恶性肿瘤增大，促使肿瘤转移复发[13]，在兔VX2肿瘤中VEGF基因亦存在高表达[14]。通过B超检查发现传统穿刺手段可引起穿刺后大多数的穿刺孔出血，qPCR技术对穿刺孔周围及通道组织中VEGFmRNA表达进行定量，亦从分子水平和细胞水平上显现肿瘤穿刺后瘤细胞转移情况，结果证明我科自制封闭穿刺装置进行的活检有效的控制了肿瘤穿此后的血肿形成及瘤细胞的瘤周组织和穿刺通道的扩散。在本实验中实验组样本行病理学检测仍有发现瘤细胞，笔者认为跟肿瘤内部压力较高有关，在行穿刺操作与封堵栓行封堵之前瞬间即可有瘤细胞外溢，这种情况的发生跟具体肿瘤性质密切相关。本课题组在成功建立了兔VX2骨肿瘤动物模型的基础上采用自创封闭穿刺活检技术，并对穿刺孔进行封堵，其克服了传统穿刺技术未及时封闭骨孔的缺陷。

现阶段的穿刺操作技术及穿刺器械逐步更新，但穿刺后仍然存在着肿瘤穿刺孔出血及血肿形成的情况、瘤细胞经针道扩散而污染周围组织等并发症[15]。此实验中应用了荧光定量PCR技术和病理学检查技术从分子及细胞水平上证明了该项穿刺技术及高分子封堵栓可有效降低骨肿瘤穿刺后瘤细胞早期扩散的的发生，给我们的骨科临床诊断提供了更安全的方向，值得在临床推广和使用。

[1] 单华超,李远，丁易,等.恶性骨肿瘤活检安全性评估[J].中华骨科杂志, 2011,31(6):676-680.

[2] Talmadge J, Resnick E.Ultrasound-guided skeletal biop-sy:a case report[J].Ultrasound Q,2013,29(3):231-233.

[3] Vieillard M H, Boutry N ，Chastanet P, et al.Contribution of percutaneous biopsy to the definite diagnosis in patients with suspected bone tumor[J].Joint Bone Spine,2005,72(1):53-60.

[4] 陈志峰，陈万青，郑莹，等.中国肿瘤登记地区人群骨肿瘤发病分析[J].中国肿瘤临床，2012，39(20):1509-1513.

[5] 李亚英, 李绍会, 任燕山,等.软骨母细胞瘤的影像学诊断(附5例分析)[J].遵义医学院学报, 2006, 29(3):281-283.

[6] Takahashi Y, Bucana C D，Cleary K R,et al.p53, vessel count, andvascular endothelial growthfactor expression in human colon cancer[J].Int J Cancer, 2006,79(1):34-38.

[7] 尹军强，王晋，谢显彪，等.一种新型穿刺活检针在骨与软组织肿瘤诊断中的临床应用[J].中华关节外科杂志，2012，6(3):361-365.

[8] 邓高荣，凌强 ，李太强，等．X线下肢体骨肿瘤穿刺活检的临床研究[J].影像与介入，2010,17(17):91.

[9] Pohlig F, Kirchhoff C ，Lenze U, et al.Percutaneous core needle bi.opsy versus open biopsy in diagnostics of bone and soft tissue sar-coma:a retrospective study[J].Eur J Med Res, 2012,17(1):1-5.

[10]Le H B, Munk P L.Image-guided musculoskeletal biopsies[J].Semin Intervent Radiol, 2010,27(2):191-198.

[11]Kasraeian S, Allison D C ， Ahlmann E R, et al.A comparison of fineneedle aspiration, core biopsy, and surgical biopsy in the diagnosis of extremity soft tissue masses[J].Clinical Orthopaedics & Related Research ,2010 ,468(11) :2992-3002.

[12]Layfield L J, Schmidt R L, Sangle N, et al.Diagnostic accuracy and clinical utility of biopsy in musculoskeletal lesions:a comparison of fine-needle aspiration, core, and open biopsy techniques[J].Di-agn Cytopathol, 2014,42(6):476-486.

[13]Kondo K，Kaneko T，Baba M，et al.VEGF-C and VEGF-A synergistically enhance lymph node metastasis of gastric cancer[J].Biol Pharm Bull，2007，30(4):633-637.

[14]Ny A，Koch M，Vandevelde W，et al.Role of VEGF-D and VEGFR-3 in developmental lymphangiogenesis:a chemicogenetic study in xenopus tadpoles[J].Blood，2008，112(5):1740-1749.

[15]金永红, 丁腾云.超声引导在肺周围型病变穿刺活检中的作用[J].遵义医学院学报, 2010, 33(1):66-67.