牙鲆tyrp1a和tyrp1b的鉴定及tyrp1a与mmu-miR-143-5p_R+2的调控关系*

王若青 王 娜 王仁凯 陈松林

(1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071)

白化是由于黑色素代谢障碍导致眼睛、皮肤、毛发黑色素量减少或缺乏而引起的一种体色异常现象。自然界中，哺乳类(柯永亮, 2006)、鱼类(李仰真等,2014)、鸟类(梁伟等, 2000)、爬行类(张秋金等, 2009)等都存在白化个体。白化个体通常出现一系列病理学上的改变，且因自身缺乏保护色而易被捕食，因此，白化个体的生存能力大大低于正常个体。白化具有广泛的遗传异质性，是最早被研究的遗传性疾病之一(Farabee, 1903)。哺乳动物如人和小鼠中白化研究最多，截止到 2011年，在小鼠中已发现的与体色、毛发相关的基因突变多达 378个(http://www.espcr.org/micemut/)。

自然界中生物体有多种多样不同的体色，这是由于自身色素细胞能产生不同的色素。虽然哺乳动物中白化突变位点众多，但色素细胞只有一种，即黑色素细胞。鱼类中已发现的色素细胞共有6种：黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞、白色素细胞和蓝色素细胞，暗示其可能的白化机制较哺乳动物更为复杂。白化在鱼类中的研究主要集中于模式鱼类斑马鱼(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)和穴居鱼类(Kogaet al, 1997)，而养殖鱼类中的研究较少。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种冷温性底栖肉食鱼类，最适温度为17℃～20℃，具有很高的营养和经济价值，深受消费者的喜爱，市场十分广阔，为我国重要的海水经济鱼种。牙鲆育苗过程中经常出现苗种高比例体色异常现象，即有眼侧皮肤白化和无眼侧黑化现象，严重影响了商品鱼价值(朱学武等,2017)。目前，认为牙鲆白化主要与营养(Seikaiet al, 1987;Yamamotoet al, 1992)、环境(Takahashi, 1994; Seikai,2010)和生理因素(Burtonet al, 1995; Seikai, 1992; Yooet al, 2000)等相关，而不管是营养还是生理方面，归根到底都是由于分子水平的变化引起的。

MicroRNA(miRNA)多为 21～25 nt高度保守的单链非编码小RNA，能够通过与靶mRNA的3′端非翻译区(UTR)互作而沉默靶mRNA，在转录后调控过程中发挥重要作用。已发现有多个miRNA参与调控哺乳动物黑色素细胞发育及相关疾病(Kimet al, 2014;Zhuet al, 2010; Donget al, 2012)。牙鲆白化现象中是否涉及miRNA的表达及调控也值得深入研究。我们在前期研究中已经利用高通量测序技术获得了一批在牙鲆正常和白化皮肤中差异表达的基因和miRNA。本研究在此基础上，选取tyrosinase related protein 1 (tyrp1)和mmu-miR-143-5p_R+2(mmu-143)开展了不同组织表达模式研究、靶基因预测及验证分析等，将为牙鲆白化发生分子机制的阐明提供重要的基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验用鱼为发育状况良好且无伤病的有眼侧皮肤全为黑色的正常牙鲆和发育状况良好且无伤病的有眼侧皮肤白化牙鲆，由山东省海阳市黄海水产有限公司提供。分别取5月龄正常和白化牙鲆的有眼侧皮肤、无眼侧皮肤、有眼侧肌肉、无眼侧肌肉、性腺、鳃、脑、肠、眼、心脏、肾脏、脾脏、肝脏13个组织样品，立即放入液氮中保存，以备后续提取 RNA使用。293T细胞培养于37℃、5% CO2条件下的细胞培养箱。

1.2 牙鲆各组织Total RNA的提取和cDNA第1链的合成

采用TIANGEN miRcute miRNA提取分离试剂盒提取牙鲆各组织的 Total RNA，然后用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的质量，用紫外分光光度计检测RNA的浓度。RNA样品于–80℃保存。

各取1 μg的Total RNA用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)进行反转录合成cDNA第1链，–20℃保存，用于克隆基因中间片段。用SMARTer®RACE 5′/3′Kit (Clontech)合成 5′和 3′ Ready，用于 5′和3′RACE的克隆。

1.3 tyrp1基因的克隆

利用转录组测序结果鉴定出tyrp1的2个转录本：tyrp1GS_012029(tyrp1-29)和tyrp1GS_009038(tyrp1-38)，此处以tyrp1-29为例进行基因克隆介绍。以正常牙鲆有眼侧皮肤cDNA为模板，以tyrp1-29-F1和 tyrp1-29-R1(表1)为引物进行中间片段的 PCR扩增，反应体积为50 μl，反应程序：94℃，5 min；94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 50 s (35 个循环)；72℃，10 min。将PCR产物回收后与pMD18-T进行连接转化反应，挑取 3～5个阳性克隆送到瑞博兴科公司测序。利用Vector NTI Advance 11软件进行测序结果的对比分析。

利用验证的中间片段设计引物tyrp1-29-5′GSP、tyrp1-29-5′NGSP、tyrp1-29-3′GSP 和 tyrp1-29-3′NGSP(表1)，以合成的 Ready为模板进行tyrp1-295′和3′RACE的巢式PCR扩增。一轮反应结束后，将一轮PCR产物稀释 50倍作为二轮 PCR的模板进行二轮PCR，将PCR产物回收后与pMD18-T进行连接转化反应，挑取3～5个阳性克隆送到瑞博兴科公司测序。利用Vector NTI Advance 11软件进行测序结果的对比分析。

1.4 tyrp1基因序列拼接及蛋白分析

在成功得到tyrp1-29和tyrp1-38基因的中间片段、5′端及 3′端后，用 Vector NTI Advance 11进行序列拼接，获得完整的tyrp1-29和tyrp1-38序列，然后进行开放阅读框分析和蛋白质翻译。从NCBI中下载其他不同物种的Tyrp1的氨基酸序列，与得到的牙鲆Tyrp1氨基酸序列进行同源性比对，用MEGA 5.0软件中 NJ法(Neighbor-joining Method)构建系统进化树，设置1000次bootstraps进行系统进化评估。

1.5 tyrp1基因实时荧光定量PCR

用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行实时荧光定量 PCR，用 Primer 6.0设计定量引物tyrp1a-qF和tyrp1a-qR(表1)进行tyrp1a基因的荧光定量检测。以β-actin为内参，以正常和白化牙鲆的13个组织的cDNA为模板，各组织均选取3个平行的实验个体，每个实验个体3次重复。ABI 7500 Realtime PCR仪(Applied Biosystems, 美国)扩增标准程序：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s (40 循环)；95℃ 15 s；60℃1 min；95℃ 15 s。

1.6 tyrp1a与miRNA的互作关系预测

利用RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni- Bielefeld.de/rnahybrid?id=rnahybrid_view_submission)将已克隆得到的tyrp1a基因3´UTR序列与miRNA进行靶基因预测，预测到tyrp1a与mmu-143可能的靶向关系。

1.7 miRNA的提取、反转录及荧光定量

由于TIANGEN miRcute miRNA提取分离试剂盒提取的牙鲆各组织的Total RNA中包含miRNA等small RNA，因此，可直接用 TIANGEN miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行反转录。

得到miRNA的cDNA后，用TM Utility 1.5-iTech设计mmu-143上游定量引物mmu-143-F(下游由定量试剂盒中提供)进行荧光定量检测。以5S rRNA(表1)为内参，以正常和白化牙鲆的 13个组织的 miRNA cDNA为模板，各组织均选取3个平行的实验个体，每个实验个体重复3次。用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green, TIANGEN)进行定量实验，反应体系：10 μl 2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)，mmu-143-F(10 µmol/L)和Reverse Primer (10 µmol/L)各 0.4 μl，2 μl 50×ROX Reference Dye，1.5 μl miRNA 第一链 cDNA，5.7 μl ddH2O，总体积 20 μl。反应程序：95℃ 15 min；94℃20 s，60℃ 34 s(40循环)；熔解曲线分析。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.8 双荧光素酶载体 pmiR-RB-REPORT™的构建及转染实验

为了证明tyrp1a3'UTR与miRNA mmu-143存在靶对应关系，采用双荧光素酶实验在293T细胞中进行验证，所用的双荧光素酶报告载体 pmiR-RBREPORT™及mmu-143 mimic和mimic Ncontrol均为广州市锐博生物科技有限公司设计提供。

用Primer 6.0设计分别带有XhoI和NotI酶切位点的上下游引物 tyrp1a-3′ UTR_F和 tyrp1a-3′ UTR_R(表1)，以正常牙鲆皮肤的 cDNA为模板，PCR扩增tyrp1a3′ UTR区片段并插入到pmiR-RB-REPORT™载体的hRluc下游，构建成载有靶片段的完整载体，与mmu-143 mimic共转染至293T细胞中(表2，A组)。另外，将pmiR-RB-REPORT™上的靶片段用TaKaRa MutanBEST Kit进行突变后与 mmu-143共同转染至293T细胞中，作为一组对照实验(表2，B组)。正常和突变的载体分别与miRNA的阴性对照NC共转染作为2组对照(表2，C组和D组)。

表2 细胞转染体系成分Tab.2 The composition of cell transfection

1.9 双荧光素酶实验

取对数生长期的 293T细胞以每孔大约 5×104细胞接种于24孔板中，于37℃、5%的CO2的条件下培养过夜后，采用lipofectamine 2000按照表2的体系进行细胞转染，37℃培养48 h后，用碧云天公司提供的双萤光素酶报告基因检测试剂盒来检测并分析miRNA与靶片段是否有互作关系。

1.10 数据计算方法

定量PCR实验中基因或miRNA的相对表达水平采用 2(−ΔΔCt)方法计算，其数据为平均数±标准误(Mean±SE)。用 SPSS 17.0分析软件采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，并进行 Duncan多重比较，当P＜0.05时认为差异显著，当P＜0.01认为差异极显著。

2 结果

2.1 牙鲆tyrp1基因全长及其蛋白分析

通过RACE方法成功克隆了tyrp1-29和tyrp1-28，tyrp1-29基因cDNA全长为2145 bp，开放阅读框(ORF)为 1566 bp，5′ UTR 区为 127 bp，3′ UTR 区为 452 bp(图1)。用Vector NTI Advance 11软件查找ORF区并翻译成蛋白质，基因编码区编码521个氨基酸，预测蛋白质分子量为58.34 kDa。分析蛋白质结构发现，第 1～17个氨基酸为信号肽，第 84～112个氨基酸为EGF区，第 172～407个氨基酸为 PFAM 结构域，469～491个氨基酸为跨膜区。

tyrp1-38基因cDNA全长1792 bp，开放阅读框(ORF)为 1602 bp，5′ UTR 区为 49 bp，3′ UTR 区为141 bp(图2)。用Vector NTI Advance 11软件查找ORF区并翻译成蛋白质，基因编码区编码533个氨基酸，预测蛋白质分子量为61.10 kDa。分析蛋白质结构发现，第27～70个氨基酸为NH区，第137～190个氨基酸为GLA区，第475～497个氨基酸为跨膜区。

2.2 系统进化树构建

将在NCBI和Ensemble查找到的11种Tyrp1蛋白序列：刺鱼(Gasterosteus aculeatus) Tyrp1a (ENSGACG00000019503)、青鳉 Tyrp1a (ENSORLG00000-004326)、河豚(Fugu rubripes) Tyrp1a (ENSTRUG-00000012615)、斑马鱼Tyrp1a (ENSDARG00000029-204)、刺鱼 Tyrp1b (ENSGACG00000015912)、青鳉Tyrp1b (ENSORLG00000004723)、斑马鱼 Tyrp1b(NP_001002749.1)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)Tyrp1 (NP_001016476.1)、鸡(Gallus gallus) Tyrp1(NP_990376.2)、小鼠(Mus musculus)Tyrp1 (NP_112479.1)及人 (Homo sapiens) Tyrp1 (NP_000541.1)与牙鲆的Tyrp1-29和Tyrp1-38一起利用MEGA 5.0软件构建蛋白序列系统进化树(图3)，序列号为 NP开头的来自于NCBI，以ENS开头的来自于在线软件Ensembl。结果显示，热带爪蟾、鸡、小鼠及人的tyrp1只有一个转录本，牙鲆tyrp1-29基因与硬骨鱼类中刺鱼、青鳉、河豚和斑马鱼的tyrp1a亲缘关系较近，而牙鲆tyrp1-38基因与刺鱼、青鳉和斑马鱼的tyrp1b亲缘关系较近。由此将牙鲆tyrp1-29和tyrp1-38分别鉴定为tyrp1a和tyrp1b基因，NCBI GenBank登录号分别为MF095844和MF095845。

图1 牙鲆tyrp1-29基因序列及其开放阅读框(ORF)预测的氨基酸序列Fig.1 ORF sequence and deduced amino acid sequence of tyrp1-29 in Japanese flounder

2.3 tyrp1a荧光定量结果

由图4可以看出，tyrp1a的表达量在正常牙鲆的眼中表达量最高，皮肤次之，第三是性腺，在肝脏、脑和脾中也均有表达，在腹部皮肤、背部肌肉、腹部肌肉、鳃、肠、肾和心脏中几乎不表达；tyrp1a的表达量在白化牙鲆的眼中表达量最高，性腺次之，第三是腹部肌肉，在皮肤、鳃和脑中也均有表达，在腹部皮肤、背部肌肉、肝脏、肠、脾、肾和心脏中几乎不表达。

2.4 靶基因预测

用Bielefeld BioInformatics Service RNAhybrid软件进行靶基因预测后，得出tyrp1a3′UTR区的第119～126 bp处与mmu-143可能存在靶对应关系(图5)。

2.5 mmu-143荧光定量结果

由图6可以看出，miRNA mmu-143在正常牙鲆的性腺中表达量最高，鳃次之，第三是肠，除了在肝脏中几乎不表达外，其他各组均有表达；mmu-143在白化牙鲆的腹部肌肉中表达量最高，肠次之，第三是性腺，在皮肤、腹部皮肤、鳃、脑、背部肌肉、肝脏、肠、脾、肾和心脏中均有表达。将 mmu-143的定量结果与tyrp1a的定量结果比较发现，tyrp1a在正常皮肤中的表达量明显高于白化皮肤，而 mmu-143在白化皮肤中的表达量约为正常皮肤中的2倍，这一结果与之前的高通量测序结果一致。

图2 牙鲆tyrp1-38基因序列及其开放阅读框(ORF)预测的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence and deduced amino acid sequence of tyrp1-38 in Japanese flounder

图3 以NJ法建立的系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree based on NJ method

图4 tyrp1a基因在正常和白化牙鲆不同组织中的表达Fig.4 Expression of tyrp1a in various tissues of control and albinism of P. olivaceus

2.6 双荧光素酶实验结果

MiRNA mmu-143与其预测靶基因tyrp1a的双荧光素酶实验结果如图7所示。一般情况下，mmu-143 mimics跟阴性对照相比，报告荧光值下调 30%及以上，则认为mmu-143 mimics对tyrp1a基因有调控作用。分析该实验双荧光素酶报告基因结果显示，mmu-143 mimic将 tyrp1a-WT的报告荧光下调38.2%，对其预测靶位点进行突变后，tyrp1a-MU的报告荧光下调15.2%。该结果表明，tyrp1a很可能是mmu-143的靶基因，mmu-143通过调控tyrp1a基因的表达来影响牙鲆的白化情况。

3 讨论

黑色素主要起到吸收光照和色素沉积的作用，而牙鲆皮肤白化主要是因为缺乏黑色素。黑色素是由酪氨酸酶及相关酶发挥作用合成的，在脊椎动物中，酪氨酸酶基因家族主要由三位成员组成：tyrosinase(tyr)、tyrp1和tyrp2(Nowaket al, 1997)。Tyrp1 被称为酪氨酸酶相关蛋白-1，定位于小鼠brown位点，该基因在真黑素形成中发挥的关键作用已引起研究者们的高度重视(Ito, 2003; Jiménez-Cervanteset al,1994)。研究发现，Tyrp1是一种由内质网合成的跨膜蛋白，通过高尔基体转运到黑色素体内(Ghanemet al,2011)，其编码蛋白与酪氨酸酶(TYR)编码蛋白同源性高达40%(Jacksonet al, 1992)，与酪氨酸相关蛋白2(Tyrp2)共同构成酪氨酸家族来调控体内黑色素合成，并且对黑色素细胞的发育、生存和功能起重要调节作用(Jiménez-Cervanteset al, 1994; Delet al, 1993;Hearing, 1999)。有实验证明，tyrp1突变或缺失会导致狗(Schmutzet al, 2002)、猫(Schmidt-Küntzelet al,2005)、牛(Berryereet al, 2003)、羊(Grattenet al, 2007)和日本鹌鹑(Nadeauet al, 2007)的毛色变成灰色。已有报道显示，硬骨鱼类中大多存在2种tyrp1的同源基因，即tyrp1a和tyrp1b(Braaschet al, 2007、2009)。本研究在牙鲆转录组数据中也发现了tyrp1的2个转录本，分析进一步证实这 2个转录本tyrp1-29和tyrp1-38分别为tyrp1a和tyrp1b基因。

图5 mmu-143的靶基因预测Fig.5 Target prediction of mmu-143

图6 mmu-143在正常和白化牙鲆不同组织中的表达Fig.6 Expressions of mmu-143 in various tissues of control and albinism of P. olivaceus

图7 双荧光素酶实验结果Fig.7 The results of dual luciferase experiment

Tyrp1a基因在正常和白化牙鲆的有眼侧皮肤、无眼侧皮肤、有眼侧肌肉、无眼侧肌肉、性腺、鳃、脑、肠、眼、心脏、肾脏、脾脏、肝脏这13个组织中的表达情况差异明显。正常和白化牙鲆各组织中tyrp1a表达量最高的是眼组织，且远远高于其他各组织的表达量，这一结果与彩鲤中的表达情况一致(李康乐,2014)，猜测tyrp1a可能参与牙鲆变态过程中眼睛的偏转及骨骼的重塑。定量结果显示，正常牙鲆皮肤中tyrp1a基因的表达量应远高于白化皮肤中的表达量，这与tyrp1a基因能促进黑色素细胞中黑素体的形成相关(崔嘉等, 2009)，且与高通量测序结果一致。其次，tyrp1a基因在正常和白化牙鲆的性腺和脑中均有表达，在腹部皮肤、背部肌肉、肠、肾和心脏中几乎不表达。

在哺乳动物和鸟类中已有实验证明，miRNA能通过调控靶基因来控制黑色素的形成，如miR508-3p(Zhanget al, 2017)、miR-21a-5p (Wanget al, 2016)、lpa-miR-nov-66 (Yanget al, 2015)、miR-204 (Apopoet al, 2015)等。MicroRNA-203能通过与驱动蛋白5b相互作用，从而调控黑色素细胞中黑色素转运和酪氨酸酶表达(Noguchiet al, 2014; Zhanget al, 2014)。因此，通过对牙鲆miRNA的表达分析，可以帮助我们去探讨miRNA在基因表达调控中的功能，更好地解释miRNA在牙鲆白化中的分子调控机制。

通过tyrp1a基因与mmu-143的定量结果可以看出，二者在正常和白化牙鲆皮肤、肌肉、性腺、肝、脑和肠中的表达呈一定的反比例关系，例如tyrp1a在正常牙鲆皮肤中的表达量远高于白化皮肤，而mmu-143在白化牙鲆皮肤中的表达量约为正常皮肤中的2.1倍。RNAhybrid软件预测结果显示，可基本确定二者存在靶基因关系，双荧光素酶实验进一步证实了这种负调控关系，说明 mmu-143是通过调控tyrp1a基因的表达来影响牙鲆白化发生的。

本研究成功鉴定出牙鲆存在 2种tyrp1基因，tyrp1a和tyrp1b基因，定量结果显示，tyrp1a在正常牙鲆皮肤中的表达量显著高于白化皮肤中的表达量，与mmu-143在正常和白化皮肤中的表达量刚好相反，均与高通量测序结果一致。双荧光素酶实验结果证明tyrp1a与 mmu-143存在靶基因互作关系。这一结果丰富了对牙鲆白化分子机制的认识。

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