三株异养硝化–好氧反硝化细菌对圆斑星鲽养殖水质的净化效果*

康传磊 李秋芬 张 艳 陈世波 王 越

(1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；3. 青岛市卓越海洋集团有限公司 青岛 266408)

近年来，水产养殖业的发展实现了由粗放式到集约化的转变，高密度养殖模式带来高产量、高收益，但同时存在水体残饵、粪便等有机物积累较快的问题。养殖水体氮浓度的快速上升，导致水体自净能力严重下降(刘道玉等, 2011)。由于氨氮和亚硝酸氮等物质对水生动物的毒性较大，严重影响了水产动物的健康和生长，给水产养殖业带来巨大损失。同时，未经处理的含高氮、高有机物的养殖废水排入沿海水域，也会加剧近海的富营养化，反过来影响养殖水质。因此，降低养殖系统中氮浓度是提高养殖水质的关键。

生物脱氮技术被认为是去除养殖污水氮元素最为有效且经济的方式，且无二次污染(Padhiet al, 2013;姜磊等, 2013; Layva-Diazet al, 2015)。Kozasa(1986)首次将微生物制剂应用于水产养殖业，此后，越来越多的硝化细菌从不同环境中分离筛选出来，并用于后续脱氮特性研究(汪晓晨等, 2014; 陆洪省等, 2014)，但传统自养硝化细菌去除水体氨氮和亚硝酸氮之后，存在硝酸氮积累的问题，同时硝化细菌生长缓慢、培养困难且价格高(罗小溪等, 2013)。

水产养殖的特殊模式决定了脱氮过程中的硝化作用和反硝化作用只存在于好氧情况下(张小玲等,2011)。但传统理论认为，自养硝化作用与厌氧反硝化作用是两个独立的部分，因此，硝化作用与反硝化作用不能在同一条件下进行(潘玉瑾等, 2016)。Robertson等(1984)在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌泛养副球菌(Paracoccus pantotropha)，异养硝化–好氧反硝化细菌的出现表明在好氧情况下可实现同时硝化反硝化(SND)。目前，筛选到的异养硝化–好氧反硝化细菌种类越来越多，已报道的脱氮细菌有假单胞菌属(Pseudomonas) (Myaharaet al, 2012)、盐单胞菌属(Halomonas alkaliphila) (孙雪梅等, 2012)、芽孢杆菌属(Bacillus)(何伟等, 2009)、不动杆菌属(Acinetobacter)(辛玉峰等, 2011)和产碱菌属(Alcaligenes)(余润兰等, 2012)等。目前，大多数研究集中在异养硝化–好氧反硝化细菌的分离筛选以及脱氮特性(Renet al, 2014; 梁贤等, 2015; 孙庆花等,2016; 石小彤等, 2013; 成钰等, 2016)，将异养硝化–好氧反硝化细菌应用于实际海水养殖环节的报道尚少。本研究将实验室筛选的 3株高效异养硝化–好氧反硝化细菌进行不同组合后应用到圆斑星鲽(Verasper variegates)养殖过程中，以探究其在实际生产中的脱氮效果，并为其应用技术的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

3株异养硝化–好氧反硝化细菌均由本实验室筛选、保存，具有异养硝化–好氧反硝化功能。嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila) X3筛选自浙江象山港网箱鱼类养殖区富营养沉积环境，在氨氮含量为42 mg/L的测试液中，24 h时，对氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的去除率分别为98.29%、99.07%和96.48%(孙雪梅等, 2012)。花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)SLWX2筛选自青岛市红岛刺参养殖池塘的水体环境，24 h对氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的去除率分别达到100%、99.5%和85.6%，在1%～8% NaCl条件下均能生长(成钰等, 2016)。

麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii) SLNX2筛选自青岛市红岛刺参养殖池塘的沉积环境，24 h对氨氮、亚硝酸氮的去除率分别达到100%、36.1%，72 h对硝酸氮的去除率达到 82.2%(拟另文发表)。下文以W代表SLWX2，X代表X3，N代表SLNX2。

圆斑星鲽由青岛卓越海洋集团有限公司提供，规格为(98±6)g。

实验所用饲料：碟类慢沉颗粒配合饲料，由常熟泉兴营养添加剂有限公司生产提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计与日常管理 实验在青岛卓越海洋集团有限公司养殖车间进行，选取规格一致的圆斑星鲽，在养殖池中暂养 10 d后，从中挑选健康、有活力的240尾进行实验，每个规格为50 L的塑料整理箱中加入30 L消毒海水和10尾已消毒圆斑星鲽；设置8个处理组，以不添加脱氮细菌的为对照组，细菌投放组合类型如表1所示，每个处理组3个平行。实验期间，第5、11、17天各投菌1次，菌液终浓度控制在1.3×106CFU/ml。实验共进行21 d。

实验期间，各池保持不换水，定时补充新鲜淡水，维持水体体积不变。使用充气泵充氧，使溶氧维持在7～9 mg/L。每日09:00投喂饲料。

1.2.2 水样采集与检测 每2天09:00投饵前，使用YSI-556多功能水质分析仪测定水质pH、溶解氧、温度和盐度。将箱内水混合均匀后，在中央距离水面10 cm处采集水样。使用离心机将水样6000 r/min离心 5 min，取上清液。参照中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局等《海洋监测规范》(GB 17378.4-2007)，氨氮的测定采用次溴酸盐氧化法，亚硝酸氮的测定采用盐酸萘乙二胺分光光度法，硝酸氮的测定采用锌–镉还原法，化学需氧量(COD)的测定采用碱性高锰酸钾法，总氮测定使用总有机碳(Total organic carbon, TOC)分析仪(TOC-VCPH, TNM-1)。

1.3 数据处理

利用Excel软件进行数据处理，实验数据用平均数±标准差(Mean±SD)表示；采用 SPSS 19统计软件对数据作统计分析，显著水平P采用0.05，极显著水平P采用0.01。

表1 实验设计Tab.1 The experimental design

2 结果与分析

2.1 各组pH、溶氧、温度和盐度的变化

实验期间，pH、溶氧(DO)、温度(T)和盐度(S)指标各组之间无显著差异(P>0.05)。pH 为 7.69±0.23、DO 为(8.325±0.385) mg/L、T为(21.95±0.55)℃、S为29.7±0.6。各组各项指标值均处于正常范围内，满足圆斑星鲽养殖条件。具体指标测定数值见表2。

表2 指标测定值Tab.2 The determined value of each parameter

2.2 不同组合的氨氮去除效果

随着养殖时间的推移，各组氨氮浓度呈逐渐升高的趋势。如图1所示，第5天第1次加菌后，各加菌组氨氮浓度上升幅度均低于对照组，并于第7～9天，各实验组氨氮浓度与对照组出现极显著性差异(P<0.01)，说明第5天投加不同组合菌液之后，氨氮去除效果显著。从第11天开始，实验组中单菌组对氨氮的去除效果开始下降，但复合组的去除能力持续有效，其中，W+X+N组合优势最为明显，与其他各实验组存在极显著性差异(P<0.01)，尤其在第17天第3次加菌后，氨氮浓度明显下降。到第 21天时，W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N组、X组、W组及 N组氨氮浓度比对照组分别降低 68.55%(P<0.01)、54.38%(P<0.01)、52.61%(P<0.01)、44.93%(P<0.01)、40.74%(P<0.01)、33.48%(P<0.01)和 26.16%(P<0.01)，说明异养硝化–好氧反硝化细菌对氨氮有很好的去除效果，其中，W+X+N组去除效果最明显，能将氨氮浓度维持在较低水平。

图1 各组氨氮浓度的变化Fig.1 The variation of ammonia-nitrogen concentration in different groups

2.3 不同组合的亚硝酸氮去除效果

实验期间，各加菌组与对照组亚硝酸氮浓度9 d前均处于较低浓度，第11天开始逐渐积累增加。如图2所示，第5天第1次加菌后，加菌组的亚硝酸氮浓度始终低于对照组，第7～15天，除单菌组(W组、X组和N组)之外，复合菌组均与对照组存在显著性差异(P<0.05)。从第17天第3次加菌后开始，各加菌组均与对照组产生显著性差异(P<0.05)，可能是3株细菌已经逐步适应养殖环境。到第19天时，W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N组、X组、W组及N组亚硝酸氮浓度与对照组差异达到最大值，分别比对照组降低 48.36%(P<0.01)、41.25%(P<0.01)、35.56%(P<0.01)、25.42%(P<0.01)、26.38%(P<0.01)、29%(P<0.01)和 17.99%(P<0.01)，说明复合细菌在去除氨氮的同时，对亚硝酸氮也有良好的去除效果。

图2 各组亚硝酸氮浓度的变化Fig.2 The variation of nitrite-nitrogen concentration in different groups

2.4 不同组合的硝酸氮去除效果

整个养殖期间，各组硝酸氮浓度的变化呈现大致先升高后下降再升高的规律(图3)。第5天第1次加菌后，第7天开始，除 N组外，各加菌组硝酸氮浓度均低于对照组，说明投加的菌液起到反硝化的作用。其中，W+X+N组反硝化作用最好，第 1～13天将水体硝酸氮浓度维持在较低水平，并于第13天达到最低浓度0.51 mg/L。到第21天时，对照组的硝酸氮已达到7.05 mg/L，各加菌组均与对照组存在显著差异(P<0.05)(除 N组外)，但各加菌组间差异不显著(P>0.05)。第21天时，W+X+N、W+X、W+N、X+N、X、W 及 N组的硝酸氮浓度分别比对照组降低58.38%、31.66%、53.04%、53.20%、50.97%、42.61%和 14.26%。说明复合细菌对硝酸氮也有良好的去除效果。

图3 各组硝酸氮浓度的变化Fig.3 The variation of nitrate-nitrogen concentration in different groups

2.5 不同组合的有机物去除效果

如图4所示，第1～5天，对照组与各加菌组之间重合度高，不存在显著性差异(P>0.05)。第 5天第 1次加菌后，第7天开始，除N组外，各加菌组COD浓度始终低于对照组，且均与对照组存在显著性差异(P<0.05)，说明投加异养硝化–好氧反硝化细菌对COD有一定的降解作用。实验期间，W+X+N组对COD的去除效果最佳，与对照组存在极显著差异(P<0.01)，W+X组次之。第 13天时，W+X+N组、W+X组、W+N组、X+N组、X组、W组及N组的COD浓度与对照组达到最大差异值，分别与对照组降低27.47%、23.08%、14.29%、17.58%、10.99%、8.79%和3.30%。说明复合细菌在去除无机氮的同时，对有机物也有一定去除效果。

2.6 不同组合的总氮去除效果

随着实验进行，各组总氮浓度缓慢上升，如图5所示，除 N组外，其余各加菌组总氮浓度均低于对照组。整个实验期间，W+X+N组及W+X组的总氮浓度均与对照组有极显著差异(P<0.01)。第 15天，W+X+N、W+X、W+N、X+N、X、W及N组的总氮浓度分别比对照组降低 40.02%、29.61%、18.58%、12.34%、29.45%、11.3%和 2.65%。结果表明，3株细菌可在养殖环境中去除一定的总氮。

图4 各组化学需氧量的变化Fig.4 The variation of chemical oxygen demand in different groups

图5 各组总氮浓度的变化Fig.5 The variation of total nitrogen concentration in different groups

2.7 不同实验组中圆斑星鲽的存活情况

实验初始，各养殖箱中放入圆斑星鲽10尾。第21天，对照组出现大量死亡现象。如表3所示，圆斑星鲽存活数量分别为4、5和4尾，存活率为40%、50%和 40%，随即停止实验。各加菌组除 W 组、N组、X+N组出现少量死亡外，其余组均无死亡现象。表明添加的 3株异养硝化–好氧反硝化细菌对圆斑星鲽无毒害及致病作用，并通过改善水体环境保证了圆斑星鲽的存活率。

3 讨论

研究结果显示，与未添加异养硝化–好氧反硝化细菌的对照组相比，W+X+N组合对氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、总氮及化学需氧量的去除效果优于其他组合，分别低于对照组68.55%、48.36%、58.38%、40.02%及27.47%，该组合与赵留群等(2014)投加EM菌实验结果相比，对氨氮和亚硝酸氮去除率分别提高了11.63%和 166.01%，与郑佳佳等(2013)复合菌实验结果相比，硝酸氮的去除率提高了3.16%。预示这些菌构成的复合异养硝化–好氧反硝化细菌菌剂能有效地降低水体中氮素含量，改善水质。各种无机氮指标基本可维持在较低水平，满足养殖的水质要求，在海水养殖生产上具有很好的应用前景。

表3 不同实验组中圆斑星鲽的存活率Tab.3 The survival rate of V. variegatus in different experimental groups

3株细菌对化学需氧量有一定的去除作用，虽然最大去除率仅为27.47%，不及马梦雪等(2016)利用硝化细菌和反硝化细菌的复合菌剂处理模拟污水的效果，但优于自养硝化细菌，且3株细菌对COD的去除仅为辅助功能，相对于传统异养反硝化菌而言，不但不需添加额外碳源，反而可消除原有的有机物。

花津滩芽孢杆菌(SLWX2)和嗜碱盐单胞菌(X3)对各项指标的去除效果均优于麦氏交替单胞菌(SLNX2)，这与 3株细菌前期进行的脱氮特性研究所取得的结果一致。同时，相同接种浓度、不同细菌组合对氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、总氮及化学需氧量均有去除作用，但去除效果不一。总体而言，3株菌复合组优于2株菌复合组，并优于单株菌组，说明3株细菌复合之后有很好的协同作用，但协同作用效果不一。

3株细菌对硝酸氮和总氮均有去除效果，3株细菌在实际生产中可起到反硝化作用。为探究脱氮细菌反硝化机制，黄廷林等(2014)利用PCR技术从3株好氧反硝化细菌中均成功检测到周质硝酸盐还原酶亚基基因(napA)，表明其可以利用napA还原硝酸氮实现反硝化功能。Li等(2012)利用斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)T13对硝酸盐还原酶进行检测，检测到硝酸盐还原酶占脱氮酶基因的30%以上。目前，被分离筛选出的众多异养硝化–好氧反硝化细菌均能实现生物脱氮功能，但不同种类菌株在脱氮途径和酶学特征上有较大的差异(吴伟等, 2013; 李嘉伟等, 2015; 李鹏章等, 2015)。此外，本研究3株细菌的脱氮途径和机制尚不清楚，3株细菌组合效果最优的原因可能为3株细菌存在的脱氮酶系不同，具有互补作用，下一步需要通过分子生物学技术，对其相关基因进行深入研究，探究3株细菌的脱氮途径与机制，来加以验证。

4 结论

3株细菌在养殖环境中均具有硝化–反硝化作用，可实现生物脱氮功能，但对圆斑星鲽养殖水质各项指标的去除效果不一，其中，SLWX2单株效果最佳。组合菌效果好于单株菌，其中，SLWX2+X3+SLNX2组合对圆斑星鲽养殖水质净化效果最佳，可使养殖水体3种无机氮的浓度维持在较低范围，SLWX2+X3组合净化效果次之。3株细菌对圆斑星鲽生长无毒害作用，使用安全。

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