洛伐他汀高产菌株的选育

摘 要：为了提高红曲霉发酵生产洛伐他汀的能力，分别采用紫外线、亚硝酸、硫酸二乙酯对出发菌株（Monascus sp.）进行诱变处理。结果表明：3种诱变剂对Monascus sp.的诱变效果有较大差异，其中紫外线诱变效果最好，硫酸二乙酯次之，亚硝酸最差。通过筛选，得到2株高产突变株，分别命名为：Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8，其产量分别为 0.239 mg/mL、0.223 mg/mL，比原始菌株分别提高了42.3%、32.7 %。遗传稳定试验结果显示，Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遗传性能较稳定，可应用于生产。

关键词：洛伐他汀；红曲霉；诱变；紫外线；硫酸二乙酯；亚硝酸

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）12-0027-03

Abatract：In order to improve lovstatin yield of Monascus sp.，the starting strains were treated by treated by UV，HNO2 and DES respectively. The results showed that three kinds of Mutagens had different effects on Monascus sp.，UV had best mutagenesis effects，then was DES and HNO2 was the worst. Two high and stable yield mutants were obtained and named Monascus sp. UV-5 and Monascus sp.DE-8 respectively.The lovstatin yield of Monascus sp.UV-5，Monascus sp. DE-8 was 0.239mg/mL and 0.223 mg/mL，which increased 42.3% and 32.7% compared with the original strain.The consecutive culture of Monascus sp. UV-5，Monascus sp. DE-8 showed that genetic performance was stable and can be used in production.

Key words：Lovstatin；Monascus sp.；Mutagenesis；UV；DES；Nitrous acid

近年来，随着经济的高速发展，人民生活水平不断提高。我国民众的饮食结构发生了很大的改变，过多地摄入高热量、高脂质的食物，导致高血脂、高血压、冠心病等“富贵病”发病率显著增加。目前，临床上治疗该类疾病的主要是他汀类药物，最重要的是洛伐他汀。洛伐他汀（Lovastatin）是一类在临床上应用广泛的降血脂、降胆固醇药物，作为体内羟甲戊二酰辅酶A（HMG-CoA）的结构类似物，能竞争性抑制HMG-CoA的代谢，减少机体内胆固醇的生成，从而对高血压和冠心病等疾病起到积极的防治作用[1-4]。当前，洛伐他汀主要是通过微生物发酵生产，在微生物发酵中，优良的菌种是获得生产成功的关键[5]。诱变育种是获得高产菌株的简便有效的手段在微生物育种中被广泛应用。课题组采用多种诱变剂对洛伐他汀产生菌株红曲霉进行处理，以期获得稳定高产菌株，为进一步开发功能性红曲提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株 红曲霉（Monascus sp.），粗糙脉胞菌（Neurospora crassa），均购于中科院微生物所，保藏于本院院生物制药国家级实训基地。

1.1.2 培养基 斜面培养基及平板培养基：马铃薯蔗糖固体（PDA）培养基；发酵培养基：马铃薯蔗糖液体（PD）培养基。

1.1.3 洛伐他汀标准品 纯度≥98%，购于上海永叶生物科技有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 HJ-1磁力搅拌器（江苏医疗）；CBV-1500A超净工作台（上海瑞仰）；QYC.2102摇床（上海福玛）；HPS-250生化培养箱（哈尔滨东明）；高效液相色谱仪（美国戴安）。

1.2 实验方法

1.2.1 紫外线（UV）诱变 在超净工作台上，用接种环取红曲霉孢子2环，用无菌水制成孢子悬液，将孢子悬液分成6份（各5mL），放在紫外诱变装置中分别处理0s、30s、60s、90s、120s、150s。然后取诱变处理后的孢子悬液0.1mL分别涂布于6个固体平板上，倒置培养3d，计算致死率[6]。再分别取0.5mL诱变后的孢子液进行管碟法试验，以抑菌圈直径为指标，初筛突变株。突变效果好的进行摇瓶发酵试验，以洛伐他汀产量为指标进行复筛，并评价诱变效果。

1.2.2 亚硝酸（HNO2）诱变 孢子悬液制备方法同1.2.1，将孢子悬液分成6份（各5mL），分别加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/L NaNO2溶液1mL，然后加入1mL pH4.4醋酸缓冲液，于32℃保温处理20min，加入pH8.6的Na2HPO4溶液，调整pH为7，终止诱变作用。适当稀释后涂布于固体进行实验，计算致死率[6]。再分别取0.5mL诱变后的孢子液进行管碟法试验，以抑菌圈直径为指标，初筛突变株。突变效果好的进行摇瓶发酵试验，以洛伐他汀产量为指标进行复筛，并评价诱变效果。

1.2.3 硫酸二乙酯（DES）诱变 孢子悬液制备方法同1.2.1，将孢子懸液分成6份（各5mL），分别加入0%、1%、2%、3%、4%、5%（v/v）的DES溶液5mL诱变处理10min，立刻加10mL的25%硫代硫酸钠溶液中止反应。诱变后的孢子悬液经过适当的稀释后，取出0.1mL孢子液涂布到分别固体平板培养基上进行实验，并计算致死率。并进行管碟法初筛和摇瓶发酵复筛，并评价诱变效果。

1.2.4 菌种筛选 采用管碟法[7]进行初筛。利用粗糙脉胞菌对洛伐他汀敏感的原理，在粗糙脉孢菌孢子液的固体培养基上进行抑菌实验，通过测量抑菌圈直径D进行初筛。

采用HPLC法进行复筛。高效液相测定洛伐他汀的条件为[8]：色谱柱：XDB C18柱；检测波长237nm，流动相：甲醇：水（体积比为70：30），柱温26℃，体积流量1.0mL/min，进样量20μL。

1.2.5 突变株遗传稳定性研究 将筛选到的实变株进行斜面传代实验，连续传种5代，分别测定洛伐他汀的产量，考察菌株的遗传稳定性能。

2 结果与分析

2.1 三种诱变剂致线曲线与分析

由图1、图3可知，红曲霉菌株对UV、DES均比较敏感，致死率与诱变剂剂量呈正相关。当UV照射时间为120s 时，致死率为72.1%。DES浓度为4%时，致死率为74.6%。由图2可知，在实验剂量范围内，红曲霉对HNO2不敏感，致死率低且变化不明显，因此，不宜选HNO2作为红曲霉的诱变剂。

2.2 UV诱变结果 从筛选平板上挑取抑菌圈直径D≥1.48cm的10株菌株孢子，置于温度为32℃、转速为160 r/min摇床上发酵7d，测洛伐他汀产量。所得结果见表1。

由表1可知，在所得到的10株突变株中，抑菌圈直径比原始菌株均有不同程度的增加，但洛伐他汀的产量则有高有低，总的来看大部分菌株的产量是提高的，即发生了正向突变，如UV-5、UV-10；而有少部分菌株的产量不升反降，如：UV-6、UV-9。其中UV-5的产量最高，达到了0.239mg/mL，相对于出发菌株提高了42.3%。说明出发菌株（Monascus sp.）对紫外线敏感，采用紫外线单因素处理即可得到较理想的诱变效果。

2.3 HNO2诱变结果 经亚硝酸诱变后，通过初筛选择9株抑菌圈直径D≥1.42cm的突变株，置于温度为32℃、转速为160 r/min摇床上发酵7d，测洛伐他汀产量。所得结果见表2。由表2可知，经亚硝酸诱变后，红曲霉对粗糙脉胞菌抑菌圈直径及洛伐他汀产量变化幅度均较小。在所得的9株红曲霉突变株中，抑菌圈变化范围1.42～1.76cm之间，洛伐他汀产量最高是HN-4、HN-8菌株，均为0.184mg/mL，比出发菌株的产量提高不到10%，说明该红曲霉对亚硝酸不大敏感，这与致线曲线分析是一致的。

2.4 DES诱变结果 经硫酸二乙酯诱变后，通过初筛选择10株抑菌圈直径D≥1.52cm的突变株，置于温度为32℃、转速为160r/min摇床上发酵7d，测洛伐他汀产量。得到结果见表3。

表3结果表明，筛选所得到的10株突变株中，大部分菌株发生了正向突变，产量均有不同程度提高，其中洛伐他汀产量最高的菌株为DE-8，达到了0.223mg/mL，增幅为32.7%。说明该红曲霉对DES较为敏感，应用DES对其进行诱变育种能得到较理想的效果。但从洛伐他汀产量的提高幅度来看，DES的诱变效果不如UV好。可能的原因是此两种诱变剂的诱变机理不相同所造成的，UV能诱发DNA形成胸腺嘧啶二聚体，导致复制中发生错配而引起突变；而DES能与DNA中碱基发生化学反应，使碱基结构发生变化，导致碱基配对的转换或颠换，从而引起突变[9]。

2.5 UV-5、DE-8遗传稳定性研究 对UV-5、DE-8菌株进行遗传稳定性能测定，在斜面培养基上进行5次传代实验，以洛伐他汀产量为测试指标，所得结果如表4所示。从表4可以看出，该2菌株洛伐他汀产量均较稳定，相對产量≥95%。表明它们的遗传性能均稳定，有一定的生产应用价值。

3 结论

采用UV、DES、HNO2 3种诱变剂分别对红曲霉进行诱变，采用管碟法初筛结合HPLC法复筛的方法选育高产菌株。实验结果表明：3种诱变剂对Monascus sp.的诱变效果有较大差异，其中紫外线诱变效果最好，硫酸二乙酯次之，亚硝酸最差。通过筛选得到2株高产突变株，分别命名为：Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8，产量分别为 0.239mg/mL、0.223mg/mL，比原始菌株分别提高了42.3%、 32.7 %。遗传稳定试验显示，Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遗传性能较稳定，可应用于生产。因此诱变育种是微生物育种中一种简便、有效的方法。但UV与DES对红曲霉诱变是否有协同作用，需进一步进行研究。

参考文献

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[2]沈平，伍军，李浩然，等.红曲固态发酵生产洛伐他汀的实验条件优化[J].北京农学院学报，2005，20（3）：47-51.

[3]李尽哲，王伟，黄雅琴.超高压对洛伐他汀生产菌株的诱变研究[J].中国酿造，2011，229（4）：58-61.

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[6]游玟娟，冯刚利.紫外线与亚硝酸复合诱变选育中性蛋白酶高产菌株[J].食品科技，2010，35（10）：23-26.

[7]吕燕妮，李平兰，江志杰.乳酸菌31-1菌株产细菌素的初步研究[J].中国食品学报，2003（增刊）：130-133.

[8]张凤琴，李小龙，刘飞，等.HPLC法检测红曲霉菌HNLI发酵液中洛伐他汀含量[J].湖南工业大学学报，2009，23（5）：26-28.

[9]周德庆.微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2002：212-217. （责编：徐焕斗）