广西壮族和汉族人群Toll样受体4基因启动子区遗传多态性研究

刘文静 何斌 张倬华 张燕婷 程初勇 黄照河

【关键词】 Toll样受体4;基因多态性;广西

中图分类号：R394.5   文献标识码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.002

A study of genetic polymorphism of Toll-like receptor 4 at promoter region in Zhuang and Han population in Guangxi

LIU Wenjing1，HE Bin，ZHANG Zhuohua，ZHANG Yanting，CHENG Chuyong，HUANG Zhaohe

【Abstract】 Objective To investigate the distribution of polymorphisms of rs10116253C/T and rs10983755G/A loci of Toll-like receptor 4（TLR4） at promoter region in Zhuang and Han population in Guangxi，and to explore their differences among various regions and groups.

Methods Snapshot SNPs genotyping assays and DNA sequencing methods were used to detect genotype and allele of rs10116253C/T and rs10983755G/A loci in TLR4 gene promoter region among 123 healthy cases in Zhuang and Han population in Guangxi，and the distribution difference of genotype and allele frequency between Hapmap-HCB，Hapmap-JPT，Hapmap-CEU and Hapmap-YRI was compared and analyzed.

Results Three genotypes（CC，CT and TT） were found in rs10116253C/T of TLR4 gene at promoter region in Zhuang and Han  population in Guangxi with the frequency of 13.82%，44.72% and 41.46% respectively，difference of the three genotypes was statistically significant between genders in Guangxi population（P<0.05）.However，there was no statistically significant difference in each allele between different genders in Guangxi population（P>0.05）.Difference of genotype and allele frequencies of rs10116253C/T between Guangxi population and Hapmap-CEU was statistically significant（P<0.05）.Three genotypes（AA，AG and GG） were found in rs10983755G/A with the frequency of 4.07%，32.52% and 63.41%，respectively.There was no statistically significant difference in each genotype and allele between different genders in Guangxi population（P>0.05），but difference of genotype and allele distribution frequencies rs10983755G/A between Guangxi population and Hapmap-CEU and Hapmap-YRI was statistically significant（P<0.001）.

Conclusion The polymorphisms of TLR4 gene rs10116253C/T and rs10983755G/A at promoter region are different in various regions and ethnic groups.

【Key words】 TLR4;gene polymorphism;Guangxi

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）蛋白被确认为基因家族中相对保守的跨膜受体之一，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白受体，是人类天然性免疫家族中的基本成員之一，并在免疫调节及炎性反应过程中发挥关键作用[1～2]。随着分子生物学水平的进步和基因组学技术的研究，作为TLRs家族中重要的成员之一的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），其多态性对疾病的影响也逐渐受到国内外学者们的关注，多项研究证实TLR4基因多个位点（如rs11536889、rs4986790、rs4986791、rs1927911、rs10759932等）具有多态性，与感染[3]、肿瘤[4]、自身免疫性疾病[5]、冠心病[6]等多种疾病的易感性及预后密切相关。但基因多态性受地区、人种及环境等方面因素的影响，故本研究拟探讨广西壮族和汉族健康人群TLR4基因启动子区rs10116253C/T、rs10983755G/A位点单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）的分布特点，同时与不同地区、不同种族人群比较，旨在分析基因多态性在不同地区、不同种族中的分布差异，为与TLR4基因有关疾病的遗传学规律及治疗等方面的研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取在右江民族医学院附属医院体检的健康人群123例，其中男性78例，女性45例，壮族80例，汉族43例，年龄38～84（59.09±9.95）岁，所有入选对象临床和实验室检查指标等均在正常范围内，彼此之间无血缘关系，且三代直系亲属均为壮族或汉族，出生并长期居住于广西地区。据知情同意原则，本研究所有研究对象均签署知情同意书，并经右江民族医学院附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA制备

所有入选对象采血前夜22：00后禁食，于早上6：00～7：00抽取静脉血约2 ml，置于含有乙二胺四乙酸三钾（Ethylene Diamine Tetraacaetic Acidtripotassium，EDTA-K3）抗凝的采血管中，立即颠倒混匀，采用DNA血液提取试剂盒提取外周血基因组 DNA（全血基因组 DNA试剂盒购自北京天根生化科技有限公司），提取后的DNA检测其浓度，达标后置于-80℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A的序列来自NCBI GenBank，引物采用Primer3软件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。TLR4基因rs10116253C/T上游引物序列：5-TCAGAGGAAGGGCTCTGGATTG-3;下游引物序列：5-TCCCTGGAAAGTTAATGGTGTTTCA-3;延伸引物序列：5 -TTTTTTTTTTTGATGTTCTGGCATCTGGGAAG-3;rs10983755G/A上游引物：5-CCACAAAATGGTCCCTCACAGC-3，下游引物：5-TGGGATTAAATGAACTGGCATTTG-3，延伸引物：5-TTTCCTCACAGCTTGGTTTTTGACAC-3。

1.2.3 PCR反应和基因测序

PCR反应体系（10 μL）包括：1GC-I buffer（Takara），3.0 mM Mg2+N，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.），1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循环程序：95℃预变性 2 min，94℃变性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，重复11个循环;然后94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，重复24个循环;72℃延伸2 min，产物4℃保存备用。取10 μL PCR产物，加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶純化后进行SNaPshot多重单碱基延伸反应，取0.5 μL纯化后的延伸产物上ABI3730XL测序仪，ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）来分析（由上海天昊生物科技有限公司协助完成）。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，Hardy-Weinberg遗传平衡检验采用Haplo View4.0软件检验群体代表性。各位点基因型和等位基因频率采用直接计数法，采用χ2检验或按Fishers确切概率法比较各组间基因型和等位基因频率分布的差异。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果

2.1 广西人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位点的分型

Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，结果显示两位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明所选样本具有群体代表性。rs10116253C/T、rs10983755G/A位点均存在基因多态性，rs10116253C/T位点存在CC、CT、TT三种基因型，rs10983755G/A位点存在GG、GA、AA三种基因型，具体基因测序验证结果详见图1、图2。

2.2 TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位点多态性在广西人群中的分布

rs10116253C/T位点的CC、CT、TT三种基因型在广西地区男女之间相比，其频率分布差异有统计学意义（P<0.05），C、T两种等位基因在广西地区男女之间相比，其频率分布差异无统计学意义（P>0.05）;rs10983755G/A位点的GG、GA、AA三种基因型和G、A两种等位基因在广西地区男女之间相比，其频率分布的差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1  。

2.3 广西人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位点多态性与其他地区人群比较

参考人类基因组计划（Hapmap）公布的非洲人、欧洲人、日本人、北京人的TLR4基因启动子区rs10116253C/T、rs10983755G/A位点SNP分型的数据（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），比较广西地区壮族和汉族人群TLR4基因启动子区rs10116253C/T、rs10983755G/A共2个多态性位点基因型和等位基因频率分布在不同地区、不同种族人群间的差异，得出中国广西人群与上述四种人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位点基因型及等位基因频率的总体分布差异有统计学意义（P<0.05）。其中，中国广西人群rs10116253C/T位点基因型及等位基因分布频率与中国北京、日本、非洲人群比较，差异均无统计学意义（P>0.05），与欧洲人群相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。中国广西人群rs10983755G/A位点基因型及等位基因分布频率与中国北京、日本人群比较，差异均无统计学意义（P>0.05），与欧洲、非洲人群相比，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表3。

3 讨  论

跨膜蛋白TLR4是TLRs中的高度保守蛋白之一，其不仅是免疫炎性反应过程中的关键受体，同时还是其信号传导途径中的起始蛋白，通过识别机体自身或外来分子，诱导炎性介质、黏附分子等物质的生成与释放或表达上调，从而引起机体自身的免疫炎性反应[1～2，7]，参与感染[8]、冠心病[9]、肿瘤[10]、自身免疫性疾病[11]等疾病的发生发展。

人类TLR4基因位于第9号染色体长臂上（9q32-q33），经人类基因组计划扫描发现TLR4基因存在着变异及多态性。研究发现，TLR4基因存在多个多态性位点，与多种疾病的发生风险相关，Proenca等[12]研究发现TLR4基因rs4986790A/G多态性与巴西人群结直肠癌患者的发生无明显相关性，国内柴利等人[13]的研究也同样发现中国汉族人群中rs4986790A/G多态性与结直肠癌的发生无明显相关性，与前面学者的研究结果一致。但Pimentel-Nunes等[14]在欧洲人群的研究中发现，rs4986790A/G位点多态性与欧洲人群结直肠癌的发病有相关性，携带纯合子基因型可能使欧洲人群结直肠癌的患病风险升高，与Proenca及柴利等学者的研究结果不一致，因此，准确分析TLR4基因多态性在不同地区、不同种族健康人群中的分布规律尤为重要，将为研究不同地区、不同种族人群TLR4基因多态性和相关疾病的发生发展之间的关系提供遗传学规律及理论参考依据。

广西位于中国西南地区，为多民族共同聚居地，其中，壮族是最主要的民族，其次为汉族人群。本实验研究采用单碱基延伸PCR技术及DNA测序方法检测广西地区壮族和汉族健康人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A 两个位点多态性的分布特点，同时与不同人群比较，分析不同人群TLR4基因SNP的多态性分布情况。结果显示，rs10116253C/T位点以CT+TT基因型（44.72%+41.46%）及T等位基因（63.82%）的频率较高，其基因型频率在廣西地区男、女之间相比差异显著（P<0.05），与Hapmap公布的4个人群（非洲人、欧洲人、日本人、北京人）的频率趋势相近，但其相对的频率分布在不同地区、不同人群有显著差异;同样，rs10983755G/A位点以GG基因型（63.41%）及G等位基因（79.67%）的频率较高，与Hapmap公布的4个人群（非洲人、欧洲人、日本人、北京人）的频率趋势也相近，但其相对的频率分布在不同地区、不同人群也有显著差异。Castano-Rodriguez等[15]针对中国人群的研究发现，rs10116253C/T位点多态性与中国人群胃癌的发生无明显相关性，但对中国东北地区人群的一项研究发现，携带CC基因型能够预示患病风险降低[16]，与前者的研究结果不同;Kim等[17]研究显示，rs10983755A/G位点多态性与韩国人群胃癌的发病有相关性，携带等位基因A较携带等位基因G的纯合子患病风险明显升高，但对中国东北地区人群的一项研究发现，携带AG或AA基因型较携带GG纯合子基因型的患病风险降低[18]，与针对韩国人群的研究结果相反。本实验的研究结果表明，不同地区、不同种族人群间同一基因位点的基因型及等位基因分布频率不同，而同一种族、同一地区的不同人群也有差异，但差异较小，不同基因位点在不同地区、不同种族人群中的分布差异不一致。本研究中，广西人、北京人、日本人均属于亚洲人群，亲缘关系较近，多态性分布趋势相似，广西人与非洲人、欧洲人亲缘关系较远，其基因多态性的分布趋势差异较大，造成这种差异的主要原因与各人群的遗传背景差异有关，此外还与不同地区的生活习惯及环境等多方面的因素有关。

综上所述，广西地区壮族和汉族人群TLR4基因启动子区rs10116253C/T、rs10983755G/A位点多态性在不同的人群和地区之间存在差异。分析不同地区、不同人群TLR4基因多态性的分布差异，给我们更进一步了解群体遗传学的认识提供帮助，为今后阐明广西地区TLR4基因多态性与相关疾病的发生发展间的联系提供参考依据，为临床上后续研究不同地区、不同种族人群在相关疾病发生机制上的差异，以及相关疾病从基因水平的靶向治疗和评估发病风险提供新的理论依据。

参 考 文 献

[1] Lee BL，Barton GM.Trafficking of endosomal Toll-like receptors[J].Trends Cell Biol，2014，24（6）：360-369.

[2] Akira S，Uematsu S，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell，2006，124（4）：783-801.

[3] Loganathan R，Nazeer M，Goda V，et al.Genetic variants of TLR4 and TLR9 are risk factors for chronic Helicobacter pylori infection in South Indian Tamils[J].Hum Immunol，2017，78（2）：216-220.

[4] Semlali A，Jalouli M，Parine NR，et al.Toll-like receptor 4 as a predictor of clinical outcomes of estrogen receptor-negative breast cancer in Saudi women[J].Onco Targets Ther，2017，10： 1207-1216.

[5] Rupasree Y，Naushad SM，Rajasekhar L，et al.Association of TLR4 （D299G，T399I），TLR9-1486T>C，TIRAP S180L and TNF-alpha promoter （-1031，-863，-857） polymorphisms with risk for systemic lupus erythematosus among South Indians[J].Lupus，2015，24（1）：50-57.

[6] 孙丹丹，吴玉鹏，杨 军，等.Toll样受体-4基因启动子区多态性与急性心肌梗死发病风险的关系[J].山东医药，2017，57（17）： 17-20.

[7] Erridge C.Endogenous ligands of TLR2 and TLR4： agonists or assistants？[J].J Leukoc Biol，2010，87（6）： 989-999.

[8] Mukherjee S，Karmakar S，Babu SP.TLR2 and TLR4 mediated host immune responses in major infectious diseases：a review[J].Braz J Infect Dis，2016，20（2）：193-204.

[9] Jia SJ，Niu PP，Cong JZ，et al.TLR4 signaling：a potential therapeutic target in ischemic coronary artery disease[J].Int Immunopharmacol，2014，23（1）：54-59.

[10] Wang X，Yu X，Wang Q，et al.Expression and clinical significance of SATB1 and TLR4 in breast cancer[J].Oncol Lett，2017，14（3）：3611-3615.

[11] Liu Y，Yin H，Zhao M，et al.TLR2 and TLR4 in autoimmune diseases：a comprehensive review[J].Clin Rev Allergy Immunol，2014，47（2）：136-147.

[12] Proenca MA，de Oliveira JG，Cadamuro AC，et al.TLR2 and TLR4 polymorphisms influence mRNA and protein expression in colorectal cancer[J].World J Gastroenterol，2015，21（25）： 7730-7741.

[13] 柴 利，黃 娟，陈 明，等.TLR基因多态性与结直肠癌易感性[J].重庆医学，2016，45（30）： 4214-4216.

[14] Pimentel-Nunes P，Teixeira AL，Pereira C，et al.Functional polymorphisms of Toll-like receptors 2 and 4 alter the risk for colorectal carcinoma in Europeans[J].Dig Liver Dis，2013，45（1）：63-69.

[15] Castano-Rodriguez N，Kaakoush NO，Pardo AL，et al.Genetic polymorphisms in the Toll-like receptor signalling pathway in Helicobacter pylori infection and related gastric cancer[J].Hum Immunol，2014，75（8）：808-815.

[16] Huang L，Yuan K，Liu J，et al.Polymorphisms of the TLR4 gene and risk of gastric cancer[J].Gene，2014，537（1）：46-50.

[17] Kim J，Cho YA，Choi IJ，et al.Effects of polymorphisms of innate immunity genes and environmental factors on the risk of noncardia gastric cancer[J].Cancer Res Treat，2013，45（4）：313-324.

[18] Li P，He CY，Xu Q，et al.Effect of the-2081G/A polymorphism of the TLR4 gene and its interaction with Helicobacter pylori infection on the risk of gastric cancer in Chinese individuals[J].Genet Test Mol Biomarkers，2014，18（9）：610-615.