一种由寡核苷酸介导的大肠杆菌ftsZ基因无痕敲除的方法

张飞飞, 杨运文, 董慧青, 尚广东*

1.徐州医科大学麻醉学院, 江苏省麻醉学重点实验室, 江苏 徐州 221004;2.南京师范大学生命科学学院, 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室, 南京 210023

重组工程是指利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组在生物基因组中进行基因克隆或DNA改造的一种基因工程技术[1,2]。目前广泛使用的重组酶基因来源于λ噬菌体的Red重组系统，包括exo、bet和gam基因，分别编码Exo、Beta和Gam 3种蛋白质分子。Exo蛋白是一种5′→3′DNA外切酶，结合在双链DNA的末端得到3′端突出的DNA分子[3]；Bet蛋白是一种单链DNA结合蛋白，结合在由Exo消化产生的3′单链DNA末端，促进该单链DNA末端与互补链退火和体内重组[4]；Gam蛋白可与RecBCD结合抑制其降解DNA的活性，协助Exo和Beta完成同源重组[5]。Red重组已经发展成为一套比较成熟的重组系统，以方法简便和重组效率高著称。作为一种高效的打靶技术，其在功能基因组学方面的研究越来越广泛。但是Red重组系统也有缺点，利用Red 重组系统敲除目标基因时有外源片段残留，如在敲除位置残留一个FRT位点序列[6]。而这些冗余序列的存在可能干扰基因组的总体结构、影响其他基因的表达，如极性效应(即一个转录单位中的一个无义突变能抑制转录单位中随后基因的转录)，也给后续的基因修饰带来困难。为实现不含任何冗余碱基的大肠杆菌基因的敲除，即无痕敲除，Yu等[7]利用Red同源重组系统和核酸内切酶 I-SceI的筛选作用，通过两步连续的同源重组成功实现无痕敲除，但是该方法仍需要通过PCR、限制性酶酶切、连接酶介导的DNA片段连接等步骤构建400～500 bp的用于基因修饰的同源片段。

近年来，因长期过度使用抗菌药物，细菌耐药性问题日益突出，使感染性疾病的发病率和病死率居高不下。研究发现，细菌中的细丝温度敏感蛋白Z(FtsZ)在细胞分裂中发挥重要作用，并且高度保守的存在于所有的细菌和古生菌中，被认为是一个非常有潜力的抗菌药物靶点[8]。

为了进一步改进和优化无痕敲除技术，本研究尝试通过一种由寡核苷酸介导的重组工程方法(single strand oligonucleotide-mediated recombineering，SSOR)来实现大肠杆菌ftsZ基因的无痕敲除,以期为细菌细胞的分裂机制及影响细胞分裂的蛋白之间相互作用的机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株和质粒 pKD4和pKD46质粒由美国普渡大学的Barry Wanner教授惠赠，pEX100Tlink由法国尼斯大学医学中心的Benoit Polack教授惠赠，pSCrhaB2由加拿大西安大略大学的Miguel Valvano教授惠赠，E.coliDH10B、MG1655、BW25141和pBluescript KS(-)为本实验室保存的菌种和质粒。

1.1.2试剂和仪器 限制性内切酶、T4连接酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒以及DNA分子量标准购自大连宝生物公司；PCR引物、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、氨苄青霉素(Ampicilin,Amp)、甲氧苄氨嘧啶(Trimethyloprim, TMP)、卡那霉素(Kanamycin, Kan)等抗生素购自上海生工公司。其余试剂均为国产分析纯。PCR仪为BioRad公司的S1000，电转化仪为BioRad公司的Gene PulserⅡ，紫外分光光度计为日本岛津公司的UVmini-1240。

LB培养基(100 mL)：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g，固体培养基加入2 g琼脂，115℃高压灭菌20 min；SOB培养基(100 mL)：胰蛋白胨2 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 0.05 g，KCl 0.09 g，115℃高压灭菌20 min，使用前加入单独灭菌的1 mol/L MgCl21 mL；SOC培养基(100 mL)：每100 mL已加入1 mol/L MgCl2的SOB中添加过滤除菌的1 mol/L葡萄糖2 mL。

1.1.3DNA测序 由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1分子生物学常规操作 大肠杆菌的培养、PCR扩增、质粒提取和酶切鉴定等实验参照手册[9]进行。表达重组酶的电转化感受态的制备，DNA的电转化以及筛选等步骤均采用Kolisnychenko等[10]的方法。本研究所使用的PCR引物序列和寡核苷酸见表1。

1.2.2质粒的构建 ①含sacB-neo基因盒的质粒的构建。以pEXT100Tlink为模板，S1和S2为引物，扩增出1.7 kb的sacB基因，将PCR产物以XbaⅠ和BamHⅠ酶切后，克隆至pBluescript KS(-)的相同位点，经酶切和测序正确后，命名为pKsacB。将pKsacB经XbaⅠ和BamHⅠ酶切后回收1.7 kb的sacB基因和pKD4经XbaⅠ和BglⅡ酶切后回收的1.0 kbneo基因通过三片段连接法克隆到pKD4/XbaⅠ位点上，转化大肠杆菌BW25141的电转化感受态细胞，经酶切鉴定后，获得重组质粒pSNR。pSNR使用R6K复制子，以含有Pir基因的BW25141为宿主菌，这样以之为模板所扩增的片段转化到常规的大肠杆菌如MG1655就不会有质粒背景的干扰。以pSNR质粒为模板，MFD5-MFD6为引物，PCR扩增得到含有同源臂的sacB-neo基因盒。为了保证靶基因的读码框不变，在设计同源臂序列时，保留了靶基因开放阅读框中的起始密码子和终止密码子。

②大肠杆菌ftsZ基因的克隆。以E.coliMG1655 基因组DNA为模板，MFD1-MFD2扩增的ftsZ基因NdeⅠ-XbaⅠ酶切后克隆至pSCrhaB2/NdeⅠ-XbaⅠ获得pLS1331，NdeⅠ-XbaⅠ双酶切鉴定并测序。

1.2.3菌落PCR 从划线长出的单菌落挑取适量的菌体到50 μL无菌水，混匀后，100℃ 处理5 min，待菌体冷却，12 000 r/min 离心5 min，每25 μL PCR体系加入5 μL 作为模板。

表1 本研究所用的PCR引物和寡核苷酸Table 1 Oligonucleotides and PCR primers used in this study.

注：下划线处表示酶切位点。

1.2.4带有同源臂的sacB-neo基因盒与ftsZ基因之间的同源重组 敲除ftsZ基因的流程如图1所示，首先将pLS1331热击转化至E.coliMGl655/pKD46感受态细胞中，于30℃、24 h在含50 μg/mL Amp和50 μg/mL TMP的LB抗性平板上筛选得到菌株MGl655/pKD46-pLS1331，其中pKD46和pLS1331使用不同的复制子，即不存在质粒不相容性。

随后根据Kolisnychenko等[10]的方法制备MGl655/pKD46-pLS1331的电转化感受态细胞。将1 μg带有同源臂的sacB-neoPCR产物按照1 800 V、200 Ω的电击条件转化至MGl655/pKD46-pLS1331的感受态细胞中，37℃、220 r/min，振荡培养1 h后，将转化液涂布于含30 μg/mLKan、50 μg/mL TMP、50 μg/mL AMP和0.2% L-鼠李糖的LB平板上，30℃培养24 h。长出来的菌落测定蔗糖敏感性，并利用MFD7-MFD8、MFD7-ZDE4、ZDE4-ZDE5这3对引物进行菌落PCR鉴定，正确的菌株命名为LS1301。

图1 SSOR法敲除ftsZ基因的流程示意图Fig.1 Schematic representation of ftsZ gene knockout via SSOR.

1.2.5寡核苷酸与sacB-neo区域之间的同源重组 用1 800 V、200 Ω同样的电击条件将5 pmol MFD9转化至新鲜制备的LS1301电转化感受态细胞，最后在37℃振荡培养1 h，涂布于含有50 μg/mL TMP、50 μg/mL Amp、0.2% L-鼠李糖和10%蔗糖LB平板上，30℃培养24 h。长出来的菌落测定Kan敏感性，并利用MFD7-MFD8引物进行菌落PCR鉴定，并进行测序分析得到LS1302菌株。

1.2.6pKD46质粒的消除 pKD46含有温度敏感型的复制起点oriRl01，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失。利用此原理，将LS1302菌株在50 μg/mL TMP和0.2% L-鼠李糖LB培养基中于30℃培养过夜，稀释106倍后涂布LB平板，42℃培养过夜，菌落测定Amp敏感性，获得菌株LS1303，保藏于-80℃冰箱。

1.2.7LS1303生长测定 挑取LS1303单菌落接种于LB液体培养基，于37℃ 220 r/min振荡培养至OD600约0.6。取19支试管，每支加入6 mL新鲜LB液体培养基，然后按照1∶100的比例将OD600约0.6的菌液接种至18支试管中，其中1支不接种作为阴性对照，于37℃ 220 r/min持续培养30 h，每间隔5 h取出3 mL菌液测定OD600值，每个时间点重复测3次，以OD600为纵坐标、培养时间为横坐标绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 带有同源臂的sacB-neo 基因盒与ftsZ基因之间的同源重组

将含同源臂的sacB-neo基因盒电转化到E.coliMGl655/pKD46-pLS1331感受态细胞后，长出462个单菌落。随机挑选25个单菌落影印至LB平板和含10%蔗糖且不加NaCl的LB平板，30℃培养16 h后，有22个表现为蔗糖敏感。当培养基中添加蔗糖时，sacB基因编码的果聚糖蔗糖酶可转化蔗糖为细菌毒素聚蔗糖而表现出对菌株的毒性，即含有sacB基因的菌株不能生存。最后从蔗糖敏感的菌落中随机挑取10个进行菌落PCR，分别以MFD7-MFD8、MFD7-ZDE4和ZDE5-MFD8为引物，最终的结果如图2中的泳道2、3、4所示，分别与预期大小3 874 bp、797 bp、997 bp相一致，表明得到了ftsZ基因被sacB-neo基因盒成功取代的LS1301菌株，其基因型为E.coliMGl655 ΔftsZ∷sacB-neopKD46-pLS1331。

图2 sacB-neo基因盒取代ftsZ基因的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of ftsZ gene replaced by the sacB-neo gene cassette.注：M1:λ-HindⅢ DNA marker; M2:DL2000 DNA marke; 1:以MFD7-MFD8为引物扩增MG1655得到2 488bp产物; 2,3,4:分别以MFD7-MFD8、MFD7-ZDE4、ZDE5-MFD8为引物扩增菌株LS1301得到3874 bp、797 bp、997 bp的产物

2.2 寡核苷酸与sacB-neo区域之间的同源重组

将SSO(single stranded oligonucleotide)MFD9电转化到LS1301感受态细胞中培养后长出42个单菌落，并且发现所有的菌落均表现为Kan敏感。随机挑取10个表型正确的菌落，以MFD7-MFD8为引物进行菌落PCR验证，其中8个与预期大小1 342 bp相一致，如图3中的泳道2所示。另外选取2个PCR产物进行测序分析，结果显示序列全部正确，没有碱基意外突变，表明实现了无任何碱基冗余的ftsZ基因的敲除，将此菌株命名为LS1302，其基因型为E.coliMGl655 ΔftsZpKD46-pLS1331。

随后根据1.2.5所述的方法进行pKD46的消除实验，随机挑取25个单菌落进行抗性验证，发现其中20个均失去了Amp抗性，表明pKD46得以消除，得到基因型为E.coliMGl655 ΔftsZpLS1331的菌株LS1303。

2.3 LS1303生长测定

为了鉴定LS1303的生长情况，尝试将LS1303在没有添加L-鼠李糖的LB培养基中生长，菌液始终较澄清，而在添加0.2% L-鼠李糖的条件下，以E.coliMGl655为对照，LS1303的OD600约为MG1655的一半，如图4所示。这些结果表明ftsZ基因的敲除是一种条件性敲除，只有在L-鼠李糖诱导pLS1331产生FtsZ蛋白时，细菌才能生长增殖。

图3 sacB-neo 基因盒敲除的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of sacB-neo gene cassette knockout.注：M:DL2000 DNA marker; 1:以MFD7-MFD8为引物扩增LS1302得到1 342 bp的目的产物

图4 E. coli MGl655和LS1303在LB培养 基中的生长曲线图Fig.4 The growth curve of E. coli MGl655 and LS1303 in the LB medium.

3 讨论

本研究中所利用的SSOR方法不仅实现了无任何碱基冗余的基因敲除，而且可以直接通过化学合成的寡核苷酸介导，无需PCR、退火、克隆等操作，简便易行，重组效率高。这在很大程度上降低了成本，节省了时间，很有可能成为大肠杆菌基因组修饰的通用方法。另外Herring等[11]利用琥珀型突变的重组方法未能获得ftsZ基因突变株，进一步证明本研究SSOR方法的可行性。目前，本课题组已经利用SSOR方法无痕敲除了LacZ基因和RhaSR基因(未发表数据)。

本研究中用于基因敲除的含同源臂的寡核苷酸MFD9为84个碱基，前42个碱基和后42个碱基分别与整合到大肠杆菌基因组上的sacB-neo基因盒前42个碱基和后42个碱基相同。长寡核苷酸效率更高，但伴随的是成本的增加和发生突变的几率增加；短寡核苷酸的重组效率会有所下降。所以，同源臂的碱基长度不可限定，一般而言，寡核苷酸的长度可以涵盖从下限36个碱基到上限约150个碱基(即为DNA碱基合成的上限)。

据报道，大肠杆菌中约有38%的基因功能尚未研究清楚[12]，研究基因功能最直接的方法是将待研究的基因敲除，而在细胞增殖分裂过程中发挥着重要作用的ftsZ基因有着较高的科研价值。FtsZ蛋白是一种类似微管蛋白的GTP酶，一些抗肿瘤药物如埃博霉素，可与微管蛋白结合导致癌细胞无法顺利进行有丝分裂，进而使癌细胞凋亡。所以，ftsZ基因突变株的构建为研究细胞分裂、寻找抗菌药物新靶点甚至肿瘤研究创造了有利的条件。

基因无痕敲除技术是遗传工程研究的一次重大飞跃，无痕系统将会得到进一步发展和完善，在基因的修饰及功能研究方面的应用也将更加广泛。

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