越南原始森林粘细菌的分离与鉴定

张鲜姣, 吕颖颖, 朱红惠

广东省微生物研究所, 省部共建华南应用微生物国家重点实验室; 广东省微生物菌种保藏与应用重点实验室; 广东省微生物应用新技术公共实验室, 广州 510070

粘细菌是革兰氏阴性菌,隶属于δ 变形菌纲，广泛分布于各类环境中[1]。根据食性，可将其分为嗜细菌和嗜纤维两种类型。现分离到的粘细菌大部分属于嗜细菌型。粘细菌的生活史较为复杂，在营养缺乏的条件下，粘细菌营养细胞可聚集形成结构复杂的子实体[2]。粘细菌因其复杂的生活史及能够产生丰富多样的活性次级代谢产物而备受关注[3]。目前，从粘细菌中已分离到大量具有抗细菌、抗真菌和抗肿瘤作用的活性物质[4～8]。随着抗生素的滥用和细菌耐药性日益严重，亟需从自然界发掘微生物源天然新药物。在过去的几年时间里，研究者从新的粘细菌种属中发现了大量的新活性物质[6,8～14]。因此，粘细菌已成为天然药物开发的重要来源，即粘细菌是继芽孢菌、放线菌之后，又一药源微生物新类群。

目前，自然环境中99%以上的微生物是在现有技术条件下尚未获得培养的，被称为不可培养微生物(viable but nonculturable,VBNC)[15,16]。近年来，研究者在改进微生物培养方法、开发新型培养技术方面开展了大量的研究，使以往被认为是不可培养的微生物源源不断地融入到可培养的行列之中，使得真正深入、有效地研究和发现微生物生理遗传等生命规律成为可能，实现微生物资源的开发和利用。目前，粘细菌的分离纯化是一个耗时耗力且漫长的过程，通常分离1株嗜细菌型粘细菌需要1～2个月；而分离1株嗜纤维型粘细菌则需1～2年的时间。正是由于粘细菌难以分离纯化，使得其可利用于活性物质筛选的菌种资源远比其他微生物资源(如芽孢杆菌、放线菌等)少。从1892年发现第1株粘细菌至今的百余年时间里，获得的可培养的粘细菌非常少；迄今有效描述的粘细菌只有3个亚目、11个科、26个属、60多个种。查阅近几年发表的新物种发现，新的粘细菌分离于各类环境中，如土壤、沼泽和海洋[17]等环境，但以土壤居多[12,13,18,19]。Garcia等[18]研究发现亚热带、热带森林中的土壤和腐木是分离粘细菌、发现新的粘细菌资源的最好来源。如Yamamoto等[20]从日本屋久岛森林土样中分离到粘细菌2个新属，并命名为Vulgatibacterincomptusgen. nov., sp. nov.和Labilithrixluteolagen. nov., sp. nov.。研究发现新的粘细菌通常能产生新的次级代谢产物。而越南是典型的热带地区，拥有丰富的热带原始森林，迄今为止，尚无从越南原始森林中分离粘细菌的相关报道。因此，从热带原始森林土壤或腐木中分离粘细菌，极有可能发掘大量的粘细菌新资源，可能得到功能新颖、遗传背景多样、有重要利用价值的粘细菌资源，从而为发现粘细菌的新活性物质和新功能提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品 本研究所用样品采自于越南潭道国家公园(Tam Dao National Park, TDNP)、菊芳国家公园(Cuc Phuong National Park, CPNP)和吉仙国家公园(Cat Tien National Park, CTNP)。随机采集土样样品16份，采样深度为0～10 cm。采集树皮与腐木样品22份。样品采集后立即风干，置于4℃保存。

1.1.2培养基 WCX培养基：CaCl2·2H2O 0.1%，琼脂1.5%，pH 7.2。灭菌后加入终浓度为50 μg/mL的放线菌酮；将大肠杆菌划十字交叉线于平板表面。

CNST琼脂培养基：KNO30.05%，Na2HPO40.025%，MgSO4·7H2O 0.1%， FeCl30.001%，琼脂1.5%，pH 7.2。灭菌后加入1 mL经过滤除菌的微量元素溶液；将灭菌滤纸铺于平板上。

VY/2培养基：安琪酵母0.5%，CaCl20.1%，琼脂1.5 %，pH 7.2。灭菌后加入VB12(终浓度为50 μg/mL)。

LB培养基：胰蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，酵母粉0.5%，pH 7.2。

CAS培养基：酶解酵素1.0%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1粘细菌分离 用灭菌的药匙取少量风干土样置于灭菌培养皿中，加入含有放线菌酮(终浓度为200 μg/mL)的无菌水中，浸泡16～20 h。对于树皮样品，用剪刀剪碎后置于培养皿中，加入含有放线菌酮(终浓度为400 μg/mL)的无菌水中，浸泡20～24 h。将浸泡过的样品于56℃处理10 min后，点接于WCX培养基和CNST培养基上，30℃培养。1周后，在体式镜下镜检观察，用灭菌的注射器针头挑取子实体或者菌膜于新鲜的WCX培养基和VY/2培养基；连续观察1个月左右。

1.2.2粘细菌纯化 通过反复转接子实体或者菌膜于新鲜的WCX培养基和VY/2培养基上，直至无杂菌生长。再将菌落转接LB液体培养基，30℃ 150 r/min振荡过夜培养，如果培养基变浑浊，说明有杂菌生长；如果培养基澄清，说明获得了纯化的菌株。并将菌株保藏于30%甘油及CAS培养基中，置于-80℃长期保存。

1.2.3粘细菌鉴定 根据子实体和菌落的形态、颜色以及营养细胞和粘孢子的形态特征，将分离到的菌株进行大致归类。

用CTAB法提取菌株DNA，采用细菌通用引物(27F和1492R)扩增16S rRNA基因，PCR反应体系为(25 μL)：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物27F/1492R(10 μmoL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR产物经电泳检测后，交至美吉测序公司测序。将所得序列在Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)进行对比分析，结合形态特征，确定菌株的种属关系。

1.2.4越南粘细菌系统发育关系 选取代表性菌株及相近的模式菌株16S rRNA基因序列，采用ClustalX做多序列比对分析，再用MEGA软件以Neighbor-Joining法构建系统发育树，完成越南原始森林可培养粘细菌的多样性分析。

2 结果与分析

2.1 越南可培养粘细菌分离纯化

从越南16个土样和22个树皮、腐木样品中共分离到70株粘细菌，经纯化后获得6个属的32株，分别是粘球菌属(Myxococcus)14株、珊瑚球菌属(Corallococcus)7株、侏囊菌属(Nanncystis)6株、蜂窝囊菌属(Melittangium)3株、原囊菌属(Archangium)1株、软骨霉状菌属(Chondromyces)1株。其中，从土样中分离到了5个属的13株粘细菌，分别是粘球菌属3株、珊瑚球菌属2株、侏囊菌属4株、蜂窝囊菌属3株、原囊菌属1株；而从树皮、腐木样品中分离到了4个属，分别是粘球菌属、珊瑚球菌属、侏囊菌属、软骨霉状菌属。软骨霉状菌是一类较为罕见且难以分离的类群，多生长于腐木及树皮上。本研究从3个树皮样品中观察到了软骨霉状菌花朵状的子实体结构，仅纯化到1株。

从分离培养基上可以观察到形态各异、颜色鲜艳的子实体(图1，彩图见图版五)。有单生(图1A)、球形(图1B、F)、有聚集成链状或者成堆(图1C、D、E、G、H、I)；而颜色有黄色、橙色、黄棕色及桔红色等。根据子实体的形态和颜色，大体可以将粘细菌归类到属。

图1 部分粘细菌子实体图Fig.1 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains. A：h11x1 珊瑚球菌(Corallococcus sp.)； B：h2x1 粘球菌(Myxococcus sp.)；C：2j2 原囊菌(Archangium sp.)；D：sex2原囊菌(Archangium sp.)；E：sjx2 侏囊菌(Nanncystis sp.)；F：h4x1粘球菌(Myxococcus sp.)；G：sh1珊瑚球菌(Corallococcus sp.)；H：h52l2 蜂窝囊菌(Melittangium sp.)；I：sax3 软骨霉菌(Chondromyces sp.)。 (彩图见图版五)

2.2 越南可培养粘细菌系统发育分析

将所获粘细菌菌株进行16S rDNA基因PCR扩增、测序，所得序列在Ezbiocloud (http://www.ezbiocloud.net) 进行比对分析。并挑选25株代表性菌株及相近菌模式序列进行聚类分析，再采用MAGE的Neighbor-Joining法构建进化树(图2)。从发育树上可发现，25株粘细菌大体分为5个分支。第Ⅰ分支属于粘球菌属(Myxococcus)，第Ⅱ分支属于珊瑚球菌属(Corallococcus)，第Ⅲ分支属于原囊菌属(Archangium)，第Ⅳ分支属于蜂窝囊菌属(Melittangium)，第Ⅴ分支属于侏囊菌属(Nannocystis)。从16S rDNA进化树上看，各菌株在属的水平上分类地位较为明确。

2.3 软骨霉状菌属子实体形成过程

分离纯化时，在3个树皮样品中观察到典型的软骨霉状菌的子实体结构(图3,彩图见图版五)，并对子实体的形成进行了连续观察。首先在培养基上长出透明的孢子囊柄和橘色透明的孢子囊球，然后孢子囊球长成花朵状；再在花朵状的孢子囊上依次长出透明的孢子囊柄和橘色透明的孢子囊球，以此往复，形成复杂的子实体团。

图2 25株粘细菌及模式菌株基因16S rDNA基因NJ进化树Fig.2 Phylogentic tree of 25 myxobacteria strains and reference strains based on 16S rDNA genes.

图3 菌株sax3 Chondromyces sp.子实体形成图Fig.3 The process of fruiting body of strain sax3 (Chondromyces sp.). A:第10天；B：第14天；C：第17天；D：第20天；E、F：第30天。 (彩图见图版五)

软骨霉状菌纯化难度大，挑取时极易沾取到杂菌，且其生长缓慢，通常14 d左右才能形成子实体。经过多次挑取，发现总有杂菌污染。将混合菌划线于LB平板上，经分离，鉴定此杂菌为假单胞菌(Pseudomonassp.)。同时发现，在有假单胞菌存在时才能观察到软骨霉状菌形成花状子实体，一旦缺乏则只见辐射状菌膜(图4，彩图见图版五)。可见此菌能促进软骨霉状菌子实体形成。

图4 软骨霉状菌sax3菌落图Fig.4 Morphological characteristics of colony of Chondromyces sp. strain sax3. A.纯的软骨霉状菌; B.假单胞菌与软骨霉状菌共培养。 (彩图见图版五)

3 讨论

粘细菌的典型生境是有机质丰富、中性或偏碱性(pH 6～8)的环境，包括土壤、腐基质丰富的腐木、树皮、厩肥和食草动物的粪便。Dawid[1]曾对全球范围内土壤中粘细菌的分布进行了深入研究，他从1 398个样品中分离了11个属的20 000个菌株。目前，研究者对粘细菌资源的挖掘多数来自于各类土壤环境。随着大量活性次级代谢产物从海洋菌株中发现，海洋微生物资源挖掘已成为研究的新热点，粘细菌也不例外。从海洋环境中发现了大量的耐盐、嗜盐以及新的粘细菌资源[17,21～23]。相反，对于粘细菌易生长的腐基质丰富的腐木和树皮样品分离研究报道极少。李越中等[24]对我国粘细菌资源进行调查时，采集了腐木及树皮样品，进行了分离纯化。河北大学刘超等[25]对大连、武汉地区进行粘细菌资源多样性研究时，对12份树皮样品进行分离，但未纯化到粘细菌。可见对于腐木、树皮样品而言，粘细菌的分离难度更大。究其原因，主要是此类样品容易滋生霉菌，且粘细菌子实体易被覆盖，难以挑取。本研究从22个越南树皮样品中分离到4个属的19株粘细菌，分别是粘球菌属、珊瑚球菌属、侏囊菌属、软骨霉状菌属。可见，越南原始森林存在着丰富的粘细菌资源。越南属于热带亚热带气候，全年高温多雨，森林面积占总面积的50%，动植物资源丰富，可为各类微生物提供丰富营养条件和栖息场所。而粘细菌喜生于有机质丰富的环境，因此热带森林的土壤和腐木是分离粘细菌的最好来源之一。本研究从越南原始森林的土壤及腐木、树皮样品中分离到多株较为罕见的蜂窝囊菌属及软骨霉菌属的粘细菌菌株，这与越南独特的地理位置和稳定的热带优越生态系统密不可分。

而在分离软骨霉状菌时，经多次纯化仍然不纯。将混合菌转接于LB培养基上，分离到1株假单孢菌。同时发现，在有假单胞菌存在时软骨霉状菌要比其单独生长时长势更好。可见，此假单胞菌能促进软骨霉状菌的生长。郭秋菊等[26]在分离纯化软骨霉状菌时，曾分离到1株能促进软骨霉状菌生长的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)。这说明，环境中确实存在着能够促进粘细菌生长发育的助长菌。由此给粘细菌的分离带来了新思路，即可以利用助长菌与粘细菌共培养技术来促进粘细菌快速形成子实体或促使未能被培养的粘细菌形成子实体。而何种菌能促进粘细菌子实体生长以及如何促其生长，则有待进一步的研究。

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