一株纤维素分解菌的筛选、鉴定及其对玉米秸秆的降解效果

王加友, 赵彭年, 杨德玉, 龙惊惊, 周 悦, 王 远

沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所, 沈阳 110021

中国是农业大国，也是秸秆资源最丰富的国家之一，据估计我国2015年农作物秸秆总产量约为9.3亿t，其中玉米秸秆年产量达到2.2亿t以上[1]。农作物秸秆是重要的生物质资源，秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素等多种物质均可以为工农业提供原料[2]。因此，农作物秸秆的资源化利用受到了广泛关注，主要包括秸秆还田、饲料化、肥料化、能源化等，而秸秆还田是其中最直接、最经济的选择[3]。

秸秆还田的方式包括秸秆粉碎直接还田、覆盖还田、过腹还田、留茬还田等。其中，秸秆粉碎直接还田即秸秆原位还田，具有快速方便、减轻劳动强度的优势，不仅可提高秸秆的综合利用率，而且是提高土壤肥力、改善土壤理化性质的有效技术手段[4]，是目前秸秆还田的主要方式，已被农民广泛应用。然而，在玉米收获的季节，我国北方玉米主产区温度偏低，原位还田的玉米秸秆在自然环境条件下不能被微生物快速分解，无法为当季作物提供肥源，秸秆原位还田腐解速度慢给农业生产带来了诸多不利影响，已成为秸秆还田推广区域生产实践中的主要障碍[5～7]。而配施适当的秸秆降解菌剂，利用微生物技术处理秸秆，为秸秆还田提供了一条有效途径[8]。秸秆分解过程中需要多种酶的参与，其中纤维素酶对促进秸秆降解具有重要作用，但是，自然环境中秸秆纤维素分解菌较少，且其在土壤中所产纤维素酶的活性较低。因此，通过添加外源秸秆降解菌，以加快秸秆的原位腐解，是促进秸秆原位降解的高效方法[9]。本研究旨在从秸秆还田土样中筛选出高产纤维素酶且对秸秆分解能力强的菌株，以期为加快本地区秸秆还田与资源化利用提供有效菌剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1土样采集 于辽宁、吉林、哈尔滨等地的玉米秸秆还田区域采集秸秆腐烂处土壤，装入灭菌后的自封袋中，置于4℃保存。

1.1.2培养基配方 富集培养基[10]：NaNO30.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，Fe2(SO4)3·7H2O(先配成1%的母液，然后取1 mL)，MgSO4·7H2O 0.5 g，玉米秸秆粉(将玉米秸秆粉碎后过60目筛)10 g，加蒸馏水至1 000 mL；分离培养基配方参照李日强等[11]的研究；鉴别培养基配方参照穆春雷等[12]的研究；液体发酵培养基[11]：KH2PO42.0 g，(NH4)2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，尿素 0.3 g，蛋白胨 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，MnSO40.001 6 g，ZnCl20.001 7 g，CoCl20.002 g，玉米秸秆粉(将玉米秸秆粉碎后过60目筛)20 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 5.5～6.0；保藏培养基为PDA培养基(配方对照沈萍等[13]的研究)。上述培养基配置好后均于121℃灭菌20 min。

1.1.3药品及仪器 实验所用分子生物学试剂均来自日本TaKaRa公司；化学试剂均为分析纯。超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，GZX-9030MBE型电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)，LDZX-50KBS型高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，HH-2型水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，SW-CJ-2FD型恒温摇床(上海博迅实业有限公司)，SHP-150型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，PCR仪(美国Bio-Rad公司)，傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津制作所)。

1.2 实验方法

1.2.1秸秆纤维素制备 参考李日强等[11]的制备方法。

1.2.2产酶菌株初筛 称取土样10 g于盛有90 mL无菌水(含已灭菌玻璃珠)的500 mL三角瓶中，制成土壤悬浊液，并在摇床上以150 r/min振荡1 h后静置5 min，随后取2 mL上清液于富集培养基中，20℃、180 r/min振荡培养3 d。将富集后的培养液梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释菌液涂布于分离培养基平板，待菌落长出后，挑取菌落于平板划线，20℃倒置培养，直至获得单菌落。将纯化后的菌株点接于鉴别培养基平板，置于20℃恒温培养箱中培养7 d后，对鉴别培养基平板用0.1%刚果红染液染色10 min，再用1 mol/L NaCl溶液脱色15 min[14]，最后，根据菌落周围形成的透明圈的大小，选取产酶能力较强的菌株。

1.2.3产酶菌株复筛 将初筛得到的高产酶菌株分别接种至液体发酵培养基中，20℃、180 r/min振荡培养5 d后，取上清液测定羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase，CMCase)酶活、滤纸酶活(filter paper activity，FPA)。酶活测定方法参考QB 2583-2003[15]。酶活定义：在pH 4.8、50℃的条件下，1 mL酶液在1 h内使底物产生1 mg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位(U/mL)。

1.2.4菌株种属鉴定 ①形态鉴定：将菌株点接到PDA固体培养基上，于20℃培养，观察菌落形态，并在显微镜下观察菌丝体及孢子的形态。②分子生物学鉴定：提取菌株基因组DNA，以提取的DNA为模板，以ITS1(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAACG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′)为引物，PCR扩增菌株的ITS序列。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(1 mmol/L)各1 μL，10×Loading Buffer 5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 2 min，共30个循环；72℃ 10 min。将扩增产物交至苏州金唯智生物科技有限公司测序，将测序结果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库BLAST中进行序列对比。使用DNAMAN 6.0软件对相近的真菌ITS区序列进行比对分析，并用MEGA 6.0软件制作进化树[16]。

1.2.5菌株所产酶酶学性质研究 酶的最适反应pH：将酶液稀释一定倍数后，在50℃条件下，分别加入pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液体系中反应60 min，测定不同pH体系中的FPA，以考察pH对酶活力的影响。酶的最适反应温度：将反应温度分别调节为5℃、10℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，在最适反应pH体系中反应60 min，测定不同温度下的FPA，以考察温度对酶活力的影响。金属离子对酶活力的影响：在最适反应pH和温度的条件下，向酶反应体系中分别加入0.5 mL 0.01 mol/L的K+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+金属离子，然后测定不同金属离子加入后的FPA，以考察金属离子对酶活力的影响。

1.2.6菌株降解玉米秸秆试验 参考秸秆腐熟菌剂腐解评价技术规程(NY/T 2722-2015)[17]，将玉米秸秆剪成3 cm左右的秸秆段，分成20 g/份装入孔径为1.0 mm的尼龙袋中，实验组加入稀释10倍的菌液(培养过程参考1.2.3)浸泡秸秆，对照(CK)组不加菌剂，另外，每组加入1 g尿素以调节碳氮比。再将每3袋秸秆埋入1个口径25 cm、高30 cm的盛土花盆中，置于15±1℃光照培养箱中进行秸秆腐解试验，光照培养箱湿度维持在50%～70%。分别于10 d、20 d、30 d、40 d时取样测定秸秆失重率，同时，每组分别取秸秆粉(将秸秆粉碎后过40目筛)1 g，按照王玉万和徐文玉[18]的方法测定秸秆降解过程中纤维素成分的变化情况，以判定菌株对秸秆的降解趋势及降解效果。

1.2.7傅里叶变换红外光谱分析 采用傅里叶变换红外光谱技术分析玉米秸秆经菌株SY-403处理10 d、20 d、30 d和40 d的样品。将秸秆样品用无菌水清洗数次以除去秸秆表面大量菌体，再放入85℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定。根据徐勇等[19]的方法，利用球磨仪将样品研磨成粉末状并过100目筛后，将样品与溴化钾(KBr)按体积比为1∶99的比例混合，再在玛瑙研钵中研磨后压片，并利用傅里叶变换红外光谱仪进行观察，波数范围为370～7 800 cm-1。每个样品重复检测3遍。

1.2.8数据分析 利用Microsoft Excel 2013软件进行数据处理和做图，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

利用固体分离培养基从土样中共分离出17株具有分解纤维素能力的菌株，再将筛选到菌株点接于鉴别培养基培养，经0.1%刚果红染色、1 mol/L NaCl溶液脱色后，有4个菌株形成的透明降解圈较大(图1，彩图见图版三)。随后，对这4个菌株进行液体发酵培养并测定其发酵上清液酶活(结果见表1)。其中，菌株SY-403发酵上清液的羧甲基纤维素酶酶活为38.67±0.11 U/mL，FPA为6.87±0.10 U/mL，其2种酶活力较其他3个菌株高，故以此菌株为研究对象开展后续试验。

2.2 菌株SY-403分类鉴定

菌株SY-403在PDA培养基上生长迅速，初生菌丝为灰白色，培养3 d后菌落开始产绿色颗粒状子囊果，菌落颜色逐渐变为深绿色(图2A,彩图见图版三)。显微镜下观察(图2B)，菌丝为无隔菌丝，分生孢子梗呈扫帚状，孢子近椭圆形。

图1 4个菌株在鉴别培养基上形成的水解圈Fig.1 Hydrolysis cycle of 4 strains on indicator medium plate. (彩图见图版三)

菌株编号CMCase酶活(U/mL)FPA(U/mL)SY-40137．79±0．235．93±0．08SY-40235．36±0．185．62±0．12SY-40338．67±0．116．87±0．10SY-40436．51±0．165．96±0．06

图2 菌株SY-403菌落形态特征Fig.2 Colony morphological characteristics of strain SY-403. A：肉眼观察；B：显微镜下观察。 (彩图见图版三)

仅通过对菌落的形态观察尚不能确定菌株的具体种属，还需通过分子生物学方法进行进一步鉴定。提取菌株SY-403的基因组DNA进行PCR扩增并测序，测得其ITS序列长度为531 bp，于NCBI数据库进行BLAST比对后发现，ITS序列与SY-403相似性最高的菌株属于蓝状菌属(Talaromyces)，其中，菌株SY-403与TalaromycesstolliiCBS 408.93(登录号NR111781.1)标准菌株相似性达到100%。再对相似性菌株采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，如图3所示，菌株SY-403与TalaromycesstolliiCBS 408.93的遗传距离最近。因此，结合形态学特征与分子生物学鉴定结果可知，菌株SY-403为Talaromycesstollii，命名为TalaromycesstolliiSY-403。

2.3 菌株SY-403所产纤维素酶酶学性质研究

2.3.1酶的最适反应pH 在50℃条件下，分别在pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液体系中，测定该纤维素酶活力。由图4可知，该纤维素酶的最适反应pH为6.0。在pH 4.0～6.0之间，纤维素酶活力逐渐升高；在pH 6.0～8.5之间，纤维素酶活力有小幅降低。

图3 基于ITS序列同源性构建的菌株SY-403系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain SY-403 based on ITS rDNA sequences homology.

图4 pH对纤维素酶活力的影响Fig.4 Effects of pH on the cellulase activity.

2.3.2酶的最适反应温度 在pH 6.0体系中，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度下，测定该纤维素酶活力。由图5可知，该酶的最适反应温度为20℃；其对温度的适应性较强，在10～50℃之间，酶活力都维持在较高的水平；在5～10℃之间，仍然具有77.39%以上的酶活力；当温度高于50℃时，纤维素酶活力迅速下降。

图5 温度对纤维素酶活力的影响Fig.5 Effects of temperature on the cellulase activity.

2.3.3金属离子对酶活力的影响 在pH 6.0、20℃的条件下，向测定纤维素酶活力的体系中分别加入0.5 mL 0.01 mol/L的K+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+金属离子溶液。由图6可知，K+、Mg2+、Fe2+对酶活力具有促进作用，其中K+的促进作用最为明显；Cu2+、Mn2+对酶活力具有抑制作用；其他金属离子对酶活力的影响不大。

2.4 菌株SY-403降解玉米秸秆试验

秸秆降解过程中，于10 d、20 d、30 d、40 d取各组秸秆并用自来水清洗干净后，置于85℃烘箱中烘干至恒重，用减重法测定秸秆失重率(图7)。

图6 金属离子对纤维素酶活的影响Fig.6 Effects of metal irons on the cellulase activity.

图7 玉米秸秆失重率的变化Fig.7 Weight loss rate of corn stalk.注：**表示同组数据与CK组相比差异极显著(P<0.01)。

对同一取样时间段的数据进行差异显著性分析，P值均小于0.01，这表明菌株SY-403处理组与CK组秸秆失重率的差异为极显著。如图7所示，两组的秸秆失重率均随时间的延长而逐渐增加，且两组秸秆失重率间的差距逐渐增大，这说明，实验后期SY-403处理组的玉米秸秆降解速度快于CK组；40 d时，菌株SY-403处理组秸秆失重率为42.67%，CK组秸秆失重率为30.59%，增幅为39.49%。

每组取秸秆粉1 g，用于测定秸秆中的纤维素含量，并计算纤维素分解率(图8)。对同一取样时间段的数据进行差异显著性分析，P值均小于0.01，这表明菌株SY-403处理组与CK组纤维素分解率的差异为极显著。如图8所示，两组的纤维素分解率随时间的延长而逐渐增加，与秸秆失重率的变化趋势一致；40 d时，菌株SY-403处理组纤维素分解率达到55.26%，高于CK组的31.42%。综合玉米秸秆失重率和纤维素分解率的测定结果，表明菌株SY-403对玉米秸秆具有良好的降解功能。

图8 玉米秸秆纤维素分解率Fig.8 Decomposition rate of corn stalk cellulose.注：**表示同组数据与CK组相比差异极显著(P<0.01)。

2.5 傅里叶变换红外光谱分析

在秸秆降解过程中取样，对秸秆降解过程中官能团的变化进行FTIR表征，结果如图9所示。经傅里叶变换红外光谱分析，与初始秸秆相比，经菌株SY-403处理10 d、20 d、30 d、40 d的秸秆样品，吸收峰数量增加，说明秸秆结构发生改变。1 052～1 054 cm-1处吸收峰强度减弱，表明纤维素及糖类物质被分解利用；1 328～1 330 cm-1处吸收峰强度增强，表明碳水化合物中羟基增多。而碳水化合物中羟基的变形振动增强，说明纤维素、半纤维素等聚合糖分解为短链结构。1 514～1 515cm-1处吸收峰强度增强，表明木质素被分解为含有苯环的化合物(如酚类等)。综上所述，菌株SY-403可以分解利用玉米秸秆中纤维素、木质素等物质，即其对玉米秸秆具有降解作用。

图9 玉米秸秆降解过程中样品的傅里叶变换红外光谱分析Fig.9 The Fourier transform infrared spectroscopy analysis results of samples during the corn straw biodegradation process. A：初始秸秆；B：降解10 d的秸秆；C：降解20 d的秸秆；D：降解30 d的秸秆；E：降解40 d的秸秆。

3 讨论

农作物秸秆是自然界中最丰富的可再生资源，如何有效利用秸秆纤维素是普遍关注的研究热点，因而，纤维素分解菌的研究受到了广泛关注[20]。本研究从秸秆还田区域中取土样，富集培养后，经筛选获得1株高产纤维素酶的菌株SY-403。结合形态学特征与分子生物学鉴定结果可知，菌株SY-403为蓝状菌Talaromycesstollii，命名为TalaromycesstolliiSY-403。并对其所产纤维素酶的酶学性质进行了初步研究，该酶最适反应pH为6.0，最适反应温度为20℃，K+、Mg2+、Fe2+对其酶活力具有促进作用，Cu2+、Mn2+对其酶活力具有抑制作用。在模拟室外低温环境(15℃)中以菌株SY-403降解玉米秸秆，菌株SY-403处理组的秸秆失重率与纤维素分解率与CK组相比，增幅分别为39.49%、75.88%，结合傅里叶变换红外光谱分析结果，表明菌株SY-403对玉米秸秆具有较强的分解利用能力。

国内有蓝状菌属黄蓝状菌(Talaromycesflavus)产几丁质酶[21]、植酸酶[22]，以及圆形蓝状菌(Talaromycesrotundus)产几丁质酶[23]的研究报道，而对蓝状菌Talaromycesstollii产纤维素酶的报道较少；国外已报道的研究中，Orencio-Trejo等[24]使用TalaromycesstolliiLV186发酵玉米和高粱的秸秆产生了纤维素酶和木聚糖酶，测定该菌株所产羧甲基纤维素酶酶活为12.47 U/mL，低于本研究中筛选到的菌株SY-403所产纤维素酶酶活，说明菌株TalaromycesstolliiSY-403具有作为产纤维素酶功能菌株的开发潜力。后续还需对菌株培养基进行进一步优化，考虑碳氮源、pH、转速等因素对酶活力的影响，以提高其产酶能力。秸秆降解试验模拟室外秸秆腐熟剂的应用环境，TalaromycesstolliiSY-403对玉米秸秆降解20 d，秸秆失重率为21.68%，高于青格尔等[25]研究中使用的复合菌系GF-20(处理20 d时，玉米秸秆失重率为20%)；降解30 d，秸秆失重率为36.43%，高于王垚等[26]研究中使用的2株戴氏霉液体发酵秸秆的失重率(戴氏霉H104.1和戴氏霉HC48.1液体发酵秸秆30 d，失重率分别为28.3%和27.4%)。上述对比结果说明本研究中筛选到的菌株TalaromycesstolliiSY-403对玉米秸秆降解的应用前景值得进一步探究。

本研究中筛选到的菌株SY-403可以作为有效降解玉米秸秆还田中纤维素的菌种资源，其在低温条件下(15℃)对秸秆的降解效果，为以后菌剂的实用性与适应性提供了参考数据。由于秸秆组成成分复杂，木质素、半纤维素等物质的分解需要其他菌群的参与，后续研究中应以菌株SY-403为基础，开展木质素、半纤维素分解菌群的筛选，以及功能菌之间相互作用的研究，开发具有作物针对性与地域适应性的秸秆腐熟菌剂。

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