模式识别受体激活状态对小胶质细胞p38-MAPK磷酸化水平的影响

郑翰轩, 张 郃

首都医科大学宣武医院药剂科, 北京 100053

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种老年神经退行性疾病，其病因复杂，已有的β淀粉样蛋白毒性学说认为，寡聚形态的Aβ42(oAβ42)引起的细胞毒性最终导致神经细胞功能紊乱，甚至凋亡，是AD发生的重要环节[1]。在脑内Aβ42形成聚集物的早期利用脑内小胶质细胞的吞噬作用对其进行清除是极具希望的AD疗法[2]。小胶质细胞的模式识别受体(PRR)根据其功能性质可分为两类：识别异物的病原感受器受体(TLRs)家族(如TLR2)和清除异物的清道夫受体(scavenger receptors，SRs)家族，如SRA、SRB、CD36受体等；两类受体分别负责机体内异物或病理性蛋白的识别与清除，并通过交互作用完成固有免疫过程。现已证实小胶质细胞表面特定模式识别受体参与AD过程中Aβ42蛋白清除的信号传递，该过程中吞噬作用的肌动蛋白重组过程需要 p38-MAPK激酶的激活，但清道夫受体如何调节其配体作用后的最终反应还不清楚。本研究通过测定小胶质细胞清道夫家族(SRs)受体和toll样受体2(TLR2)在Aβ42诱导的小胶质细胞中对p38-MAPK磷酸化信号水平的影响，探讨清道夫家族受体和toll样受体在该吞噬信号传递过程中的作用，以期研究胶质细胞被oAβ42诱导时，SRA受体和TLR2受体的状态对p38-MAPK磷酸化信号水平的影响，并进一步研究TLR2受体被其抗体中和时，细胞对oAβ42的吞噬量的变化，从而为在分子水平调节胶质细胞与Aβ42相互作用的受体激活剂、基因封闭剂等AD免疫疗法提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料

大鼠抗小鼠SRA(AbD Serotec公司)、SRB(Abcam公司)、CD36(Abcam公司)抗体、蛋白磷酸化检测试剂盒(Abcam)、受体内吞抑制剂 (pitstop，Abcam公司)、oAβ1-42检测试剂盒(IBL公司)、BCA 试剂盒(Pierce公司)、Aβ42(American Peptide公司)、抗鼠TLR2-功能性抗体(Invivogen公司)、蛋白酶抑制剂(Calbiochem公司)、DMSO(Sigma公司)、DMEM 培养液(HyClone公司)。

1.2 方法

1.2.1Aβ42寡聚体的制备 制备Aβ42蛋白寡聚体，使分散的Aβ42蛋白单体在低温条件下缓慢聚集形成刺激性及毒性较强的寡聚形态Aβ42(oAβ42)，最后14 000 g高速离心去除纤维形态及高聚集形态的oAβ42[3]，具体方法为：用1.3 μL DMSO把分装后30 μg的Aβ42(分子量4 514 g/moL)薄膜重悬为5 mmol/L，水浴超声10 min，补入65.1 μL细胞培养基配置成100 μmol/L，在4℃孵育24 h，制得oAβ42母液。Aβ42使用浓度解释：在上述66.4 μL母液中加入6.6 mL培养基，混匀，制得1 μmol/L的oAβ42实验液。在66.4 μL母液中加入3.3 mL培养基吹打混匀，制得2 μL的oAβ42实验液，取44 μL母液,加入956 μL培养基混匀，制得20 μg/mL的oAβ42实验液。

1.2.2蛋白磷酸化水平的荧光测定 将状态良好的BV2小胶质细胞按实验分组接种至96孔细胞培养板，每孔约1×104个细胞，37℃、5% CO2环境培养24 h。

胶质模式识别受体的激活：单独细胞、细胞+岩藻糖(100 μg/mL)、细胞+oAβ42(20 μg/mL)，每组6个复孔，实验组向细胞加入岩藻糖(100 μg/mL)，oAβ42(20 μg/mL)孵育1 h，检测各组p38-MAPK磷酸化水平。

胶质细胞模式识别受体的阻断：单独细胞，细胞+oAβ42，细胞+各模式识别受体的功能性抗体(SRA，SRB，CD36，TLR2)+oAβ42，每组6个复孔。实验组向细胞加入模式识别受体SRA、SRB、CD36、TLR2的功能性抗体(10 μg/mL)孵育1 h后，各组细胞加入2 μmol/L的oAβ42孵育1 h，检测p38-MAPK磷酸化水平，具体方法为：配制p38-MAPK磷酸化蛋白的捕获抗体与检测抗体等体积混合物，与各孔的细胞裂解液共同转移至相应磷酸化蛋白检测孔板，于室温300 r/min孵育1 h，弃去检测孔板中的未结合裂解液-抗体混合物，洗涤后加入等体积ADHP显色底物室温孵育10 min, 之后各孔加10 μL停止液终止反应，以530～540 nm为激发光波长，于590～600 nm处检测荧光信号的强度。

1.2.3TLR2受体功能性阻断剂及受体内吞抑制剂对oAβ42吞噬量的影响 用TLR2受体(10 μg/mL)、受体内吞抑制剂(endocytosis inhibitor，30 μmol/L)分别作用小胶质细胞75 min。以上不同实验组分别加入oAβ42(1 μmol/L)孵育1.5 h，检测细胞中的oAβ42水平。按照试剂盒说明书提供的方法测出细胞裂解液上清中oAβ42的量，每组结果用各组细胞测定的BCA蛋白浓度进行校正后，各组结果以对照组(只加入oAβ42孵育)细胞测得的oAβ42含量为100%换算成百分比，即被BV2细胞吞噬的oAβ42的量。

1.2.4统计学检验 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验中的计量资料以3次或3次以上实验结果的平均数+标准差表示，采用t测验法检验各组处理的差异显著性。当P<0.05时认为差异具有显著统计学意义，P<0.01时认为差异具有极显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 模式识别受体激活对p38-MAPK磷酸化水平的影响

首先利用小胶质细胞的非特异性配体岩藻糖(100 μg/mL)与特异性配体oAβ(20 μg/mL)作用小胶质细胞，测定细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化程度。结果如图1所示。结果显示，小胶质细胞受到模式识别受体的非特异性配体岩藻糖活化后，磷酸化水平显著增加(P<0.01)，使用较高浓度的oAβ42(20 μg/mL)激活细胞模式识别受体后，由于吞噬等一系列作用，引发p38-MAPK磷酸化水平升高。同时观察到两个实验组中小胶质细胞由细长突起静息状态转变为圆形或椭圆形的活化状态。

图1 岩澡糖与寡聚形态Aβ42对小胶质细胞 p38-MAPK磷酸化水平的影响Fig.1 Effect of fucoidan and oligomer Aβ42 activate on p38-MAPK phosphorylation level in micorglia.注：**表示与单独细胞组相比差异达到极显著水平(P<0.01)。

2.2 模式识别受体的阻断降低oAβ42诱导的p38-MAPK磷酸化水平

分别采用小胶质细胞表面受体SRA、SRB、CD36、TLR2的功能性抗体预先作用小胶质细胞，使上述受体被中和，再测定上述特定实验组的小胶质细胞被Aβ42(oAβ42)刺激引起的p38-MAPK磷酸化水平变化。结果如图2所示，结果表明，2 μmol/L的oAβ42作用小胶质细胞可以明显提高p38-MAPK的磷酸化水平的荧光值，相同条件实验组中事先分别用10 μg/mL的SRA、SRB、CD36、TLR2受体功能性阻断剂处理细胞再加入oAβ42，p38-MAPK磷酸化水平均降低，其中，SRA和TLR2抗体处理组p38-MAPK磷酸化水平经统计学检验与对照组(oAβ42单独处理组)具有极显著性差异(P<0.01)。

2.3 TLR2受体功能性阻断剂对oAβ42吞噬的影响

已有研究证实清道夫家族SRA受体参与小胶质细胞对oAB42的吞噬过程[4]，而TLR2作为典型的病原识别性受体，与之相关的p38-MAPK磷酸化过程对小胶质细胞吞噬的影响还不明确，为进一步探讨该p38-MAPK信号对于小胶质细胞摄取oAβ42过程的影响，用TLR2受体特异性抗体处理小胶质细胞，检测TLR2受体中和后oAβ42的细胞吞入水平并与正常小胶质细胞对比。另外，为探讨上述模式识别受体激发的磷酸化过程是否与经典的受体内吞过程相关，同时检测受体内吞抑制剂(endocytosis inhibitor)处理对细胞摄取oAβ42过程的影响，结果如图3所示,TLR2受体中和后oAβ42的细胞吞入水平与正常小胶质细胞相比显著降低。受体内吞抑制剂(endocytosis inhibitor)可通过作用于细胞内吞必须的网格蛋白抑制经典细胞的内吞过程，但该抑制剂对上述oAβ42的细胞吞入过程后的细胞内oAβ42蛋白测定结果没有显著影响，上述结果说明模式识别受体对oAβ42的清除过程不属于经典的细胞内吞过程。

图2 模式识别受体阻断剂抑制oAβ42诱导的胶质细胞p38-MAPK磷酸化过程Fig.2 PRR blocking antibodies reduce the level of p38-MAPK phosphorylation in micorglia.注：**表示与oAβ42单独处理组的小胶质细胞相比差异极显著(P<0.01)。

图3 TLR2受体特异性抗体及受体内吞抑制剂 对于oAβ42摄取的影响Fig.3 The influence of TLR2 blocking antibody and endocytosis inhibitor on oAβ42 internalization in microglia.注：*表示与oAβ42单独处理组相比差异显著(P<0.05)。

3 讨论

目前AD主要通过增加神经递质的药物对症治疗延缓临床症状，尚缺乏对因治疗的手段[5]。小胶质细胞在AD进程中是一把双刃剑[6]，其中吞噬激活的状态决定了病程的走向[7]，小胶质细胞的吞噬失能是AD的重要病因之一[8]，激活脑内小胶质细胞或引入外周小胶质细胞对脑内错误折叠的Aβ42蛋白进行清除是极具希望的AD免疫疗法[6]。有研究表明p38-MAPK的磷酸化激活与小胶质细胞吞噬过程的肌动蛋白丝运动相关，而其抑制剂可以减弱细胞的吞噬[7]，本研究中首先利用岩藻糖与oAβ42作为诱导物作用于小胶质细胞，观察到该细胞p38-MAPK的磷酸化激活现象，岩藻糖是来自褐藻的一种多聚阴离子多糖[9]，该多聚阴离子结构正是胶质细胞模式识别受体家族的共同识别域，因此属于非特异性配体，已有研究证实其可减缓注射Aβ蛋白的AD模型大鼠中学习与记忆功能的损害，该作用可能是由于其受体占位作用，而阻止了Aβ蛋白的模式识别受体过强毒性而产生，岩藻糖引起了较高的p38-MAPK的磷酸化水平，证实了模式识别受体激活后胶质细胞的活化作用。进一步地，在模式识别受体SRA及TLR2受体被相应抗体阻断的小胶质细胞在受到Aβ42蛋白激活后引起p38-MAPK的磷酸化水平比对照组显著降低，说明SRA受体以及TLR2受体参与了oAβ42引起的p38-MAPK磷酸化过程。小胶质细胞的模式识别受体(PRR)的两类受体(病原感受器受体家族和清道夫受体家族[10])分别司职异物的识别与清除，并通过交互作用完成固有免疫过程，但是目前还不清楚清道夫受体如何调节其配体作用后的最终效应，一种可能是SR的存在为其配体转移到其他的PRR(尤其是TLRS)提供了便利[11]。但与此矛盾的是，在CD14、TLR2、TLR4基因缺失的动物中，分离的小胶质细胞无法诱发p38-MAPK的磷酸化，也暗示了病原感受器缺失的小胶质细胞传递吞噬信号的失能[12]，则TLRS家族受体信号产生在SR家族受体信号之前。一项阿尔茨海默病的小胶质细胞基因网络研究表明[13]，小胶质细胞经由5种途径组成的固有免疫体系参与并影响该疾病的进程：病理蛋白清除系统(清道夫受体系统)、病理蛋白识别系统(Toll样受体家族)、辅助病理蛋白清除系统(补体系统)、细胞通讯系统(趋化因子系统)和自身标志系统(MHC分子系统)。本研究中，观察到属于胶质细胞中病理蛋白识别系统的TLR2受体的抑制直接降低了小胶质细胞的吞噬量，说明病原感受型受体虽然本身并不直接参与吞噬过程，但其失能会直接影响胶质细胞对病理性蛋白的清除，另外，该过程采用经典受体内吞抑制剂(网格蛋白抑制剂，endocytosis inhibtor)处理细胞，对于oAB42的吞入量影响并不显著，提示上述TLR2引发的p38-MAPK信号相关的蛋白清除现象属于受体激发的吞噬过程(receptor initiated phagocytosis)[14]，而不是传统意义上由网格蛋白介导的受体内吞(receptor-mediated endocytosis)形式[15]。本研究证实，模式识别受体TLR2参与小胶质细胞吞噬激活所必须的p38-MAPK信号转导过程影响了病理蛋白的清除量，提示该受体家族有望成为AD免疫治疗的干预靶标。

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