蒺藜苜蓿株高控制基因COSTIN的克隆及功能研究

李 辉, 殷鹏程, 祝步拓, 林 浩, 刘志强, 裴雁曦*, 牛丽芳*

1.山西大学生命科学学院, 太原 030006;2.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界著名的优良牧草，也是我国栽培面积最大的一种豆科饲料作物，由于其具有蛋白质丰富、适应性强、能改良土壤和经济价值高等优点而享有“牧草之王”的美誉[1]。株高是直接决定苜蓿生物产量的重要农艺性状，同时也是衡量牧草生长状况的重要生理指标之一[2]。苜蓿的株高性状在整个生长周期中大致呈现“S”型变化，已有研究发现株高越高的苜蓿品种，其生物产量也相对较高，株高性状与苜蓿草产量之间呈正相关关系[3]。但目前关于苜蓿等豆科牧草株高性状的分子调节机制还有待深入研究。

植物激素赤霉素(gibberellic acid,GA)在植物株高性状的形成过程中发挥重要调控作用，已有研究发现GA合成途径中的关键酶包括：古巴焦磷酸合成酶CPS(ent-copalyldiphosphate synthase)、内根-贝壳杉烯合成酶KS(ent-kaurene synthase)、内根-贝壳杉烯氧化酶KO(ent-kaurene oxidase)、内根-贝壳杉烯酸氧化酶KAO(ent-kaurene acid oxidase)、GA3氧化酶GA3ox(GA3-oxidases)和GA20氧化酶GA20ox(GA20-oxidases)[4]等的功能缺失均导致植物呈现矮化的表型，而外源施加GA可使上述突变体的株高完全恢复到野生型水平[5]。

Ca2 +/阳离子转运蛋白(cation calcium exchanger/CAX)是一种选择性运输钙(Ca2+)等阳离子的转运蛋白，是Ca2+/cation antiporter(Cation/H+antiporter，CaCA)大家族的一个分支[6]，在调节植物生长、提高养分吸收和减轻土壤中污染物等方面发挥重要作用。拟南芥中的研究发现CAX蛋白通过调节植物细胞内离子稳态、pH和氧化还原水平的生理指标，使植物细胞适应一系列的非生物胁迫[7,8]。在重金属离子胁迫条件下，CAX4(离子/ H+反向转运蛋白)对于维持拟南芥根生长发育具有的重要调控作用[9]。此外，在拟南芥和棉花中的研究发现，CAX蛋白同样参与调控植物对冷胁迫的应答反应[10,11]。但目前关于CAX家族蛋白参与调控植物株高方面的研究还鲜有报道。

本研究利用豆科模式植物蒺藜苜蓿为实验材料，通过定向筛选分离鉴定了一个矮化突变体compactstalkinternodes(costin)， 通过正向遗传学的方法克隆了COSTIN基因，该基因编码一个钙离子交换蛋白，进一步研究发现在costin突变体中赤霉素合成途径关键基因表达下调，同时外施赤霉素GA3可以恢复costin突变体的矮化表型，表明COSTIN基因可能通过影响植物激素赤霉素的生物合成来调控蒺藜苜蓿的茎节伸长最终导致植株的矮化，本研究旨在为揭示苜蓿等豆科牧草株高性状形成的分子机制及遗传改良研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料 野生型材料为蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) R108，由实验室保存。蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体NF15084(costin-1)、NF3011(costin-2)和NF2734(costin-3)购自美国诺贝尔研究所。蒺藜苜蓿生长条件为：温度24℃，湿度 70%，光照强度 380 μM/m2·S，光周期 16 h(光)/8 h(暗)，适时浇灌，用于DNA、RNA提取和表型数据收集。

1.1.2实验试剂 高保真酶KOD FX购自东洋纺公司；2×TaqPCRMix购自艾德莱生物科技有限公司；TRIzol和焦炭酸二乙酯(DEPC)购自Invitrogen公司；反转录试剂盒TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和实时荧光定量试剂盒Trans Tip Green q-PCR SuperMix购自TransGen Biotech公司；赤霉素GA3购自Sigma公司。

1.1.3实验器材 Eppendorf centrifuge 5424R/5702R/5430R 离心机、Roche LightCycler 96 型Real-time PCR system、Bio-Rad 稳压稳流电泳仪、原平皓凝胶成像系统、NanoDrop 2000c和Nikon EOS 600D 照相机。引物合成和测序由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1蒺藜苜蓿表型数据收集 取生长4周左右的植株苗，收集野生型和costin突变体的表型。统计从下往上数第二复叶到第三复叶的节间距和从下往上数第五片复叶顶生小叶的面积，并用Image J进行节间距和叶片面积的测量。

1.2.2定量PCR检测突变体中COSTIN基因表达情况 采用Trizol法分别提取蒺藜苜蓿生长4周的野生型、NF15084、NF3011和NF2734的复叶总RNA, 参照TransGen Biotech反转录试剂盒TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的操作说明合成cDNA的第一条链。以植物体内组成型表达的基因MtActin作为内标(引物序列见表1)，使用半定量RT-PCR的方法对3个突变体中的COSTIN基因表达情况进行检测(特异性引物序列见表1)。PCR反应体系为(10μL)：2×TaqMix 5 μL,模板cDNA 1 μL,引物COSTIN-F(10 μmol/L)、COSTIN-R(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3 μL。PCR反应程序：98℃ 2 min；98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 2 min；24℃ 1 min。其中MtActin基因28个循环，COSTIN基因40个循环。

表1 实验所用引物序列Table 1 Primers used in the experiment.

1.2.3COSTIN蛋白序列分析 将COSTIN蛋白序列在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源比对，筛选获得与拟南芥同源性最高的CAX7蛋白。随后用BioEdit软件对COSTIN与CAX7蛋白进行序列比对分析。

1.2.4荧光实时定量PCR 收集不同发育时期野生型的各个组织，包括生长4周的根和根瘤，生长2周的子叶、单叶和未展开的复叶，生长4周展开的复叶，营养生长时期苗的顶端，茎，生殖生长时期苗的顶端、幼花、成熟花和直径3 mm的果荚，用于分析COSTIN基因的组织表达特异性。收集生长4周野生型和costin突变体的未展开复叶用于比较赤霉素合成途径关键基因(CPS、KS、KO、KAO1、GA20ox1、GA20ox2、GA20ox4、GA20ox6、GA20ox7和GA3ox1[12,13])的表达变化。采用Trizol法提取上述各组织的总RNA，参照TransGen Biotech反转录试剂盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)的操作说明合成cDNA的第一条链。随后以反转录合成的第一条cDNA链为模板，参照TransGen Biotech的Trans Tip Green q-PCR SuperMix的操作方法用荧光定量特异性引物进行实时荧光定量PCR(特异性引物序列见表1)，3次生物学重复。用MtActin作为内参基因进行归一化处理。实时荧光定量PCR反应在Roche LightCycler 96实时荧光定量PCR仪上进行，用2-△△Ct计算方法分析结果。引物序列见表1。

1.2.5costin突变体外施赤霉素(GA3)处理 为了研究外源GA3处理对突变体株高的影响，将野生型和costin突变体种植于温室中生长1周后，隔天喷施2 mmol/L GA3溶液。由于GA3是用无水乙醇溶解的，所以对照组的植物材料喷施同样计量的无水乙醇。喷施3周后观察野生型和costin突变体下部节间生长状况。

2 结果与分析

2.1 costin突变体分离及其表型分析

为了研究蒺藜苜蓿株高调控的分子机理，我们从蒺藜苜蓿Tnt1逆转座子插入突变体库中筛选获得突变体NF15084，相比于野生型(图1A,1C，彩图见图版二)，其植株明显矮化(图1B,1D)。该突变体下部节间(图1F)明显短于野生型(图1E)，因此将其命名为compactstalkinternodes-1(costin-1)。对野生型和costin-1突变体从下往上数第二复叶和第三复叶的节间距进行测量发现costin-1节间距与野生型相比显著缩短(图2A)；且costin-1突变体叶片(图1G)明显偏小(图1H)，对野生型和costin第五复叶的顶生小叶进行测量发现costin-1叶面积显著减小(图2B)。

图1 costin-1突变体表型Fig.1 The phenotype of costin-1.注：A、C、E、G: 野生型植株；B、D、F、H: costin-1突变植株；A～D：植株形态； E、F：下部节间；G、H：第五片复叶(Bars=1 cm)。 (彩图见图版二)

图2 野生型和contin-1突变体下部节间距和叶面积统计Fig.2 The length of stalk internode and area of leaves in wild type and costin-1. A：野生型R108与costin-1突变体第二复叶和第三复叶的节间距；B：野生型R108和costin-1第五复叶的顶生小叶叶面积。其中，样品数为 15，**表示与野生型相比差异极显著(P<0.01)。

上述结果表明costin-1突变体的矮化是由于下部节间生长受到抑制所导致的。

2.2 COSTIN基因克隆

为了寻找costin-1植株矮化的控制基因，我们在蒺藜苜蓿Tnt1数据库(https://medicago-mutant.noble.org/mutant/database.php)下载并分析了NF15084的侧翼序列，基于表型和基因型连锁性分析的结果(图3)，鉴定到一个候选基因Medtr6g027580，该基因只含有一个外显子。costin-1突变体中的Tnt1插入在Medtr6g027580基因的520 bp处(图4A)。RT-PCR检测发现costin-1突变体中没有全长COSTIN基因的表达(图4B)。为了进一步证明COSTIN基因与表型的连锁关系，我们用该基因的另外两个Tnt1插入突变体NF3011(costin-2)和NF2734(costin-3)，costin-2中Tnt1插入在编码区310 bp处，costin-3中Tnt1插入在编码区828 bp处(图4A)，这两个突变体的纯合子均表现出与costin-1相似的表型。RT-PCR检测发现在costin-2和costin-3中也没有全长COSTIN基因的表达(图4B)。上述结果证明costin-1突变体植株矮化和叶片变小等发育异常的表型是由于COSTIN基因的功能缺失造成的。

图3 表型基因型连锁性分析Fig.3 Genotyping analysis of costin-1.注：R108为对照野生型，1～3为突变体的矮化表型；4～13单株为野生型表型。

图4 COSTIN基因结构图和突变体中CONTIN的表达检测Fig.4 Molecular cloning of COSTIN in M. truncatula. A：COSTIN基因结构示意图和Tnt1逆转座子的插入位置。B：RT-PCR检测CONTIN在突变体中的表达。

2.3 COSTIN蛋白序列比对

如图5(彩图见图版二)所示，蛋白序列比对发现COSTIN与拟南芥钙转运蛋白CAX7 (CALCIUM EXCHANGER 7) 高度同源，氨基酸序列一致性为50%，同时具有α-1和α-2两个保守结构域，是阳离子的结合结构域。

2.4 COSTIN基因的组织表达模式分析

COSTIN基因在蒺藜苜蓿中发挥的功能目前还没有任何报道，为了明确COSTIN在苜蓿生长发育过程中可能发挥的作用，分析了COSTIN基因的组织表达模式。实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 检测发现COSTIN基因在蒺藜苜蓿的叶、茎和果荚中具有较高表达量，与COSTIN基因的生物学功能相吻合(图6)。

2.5 赤霉素对株高的影响

由于costin突变体植株矮化，推测可能是由于其内源赤霉素含量减少所导致，于是对野生型和costin突变体植株进行外喷GA3处理。取生长1周的幼苗，隔天喷施2 mmol/L的GA3，一个月后进行表型观察。由于GA3溶解在无水乙醇中，因此外喷相应量的无水乙醇溶液作为对照。与未喷施GA3的野生型对照相比(图7A，彩图见图版三)，外施赤霉素使得野生型下部节间明显伸长(图7C)，说明植株对外源GA3响应正常。与未喷施GA3的costin突变体植株相比(图7B)，外喷GA3使得costin植株下部节间明显伸长(图7D)，长度接近于喷施GA3的野生型对照(图7C)，表明costin突变体植株矮化的表型确实是由于其内源赤霉素含量降低所导致。

图5 COSTIN与CAX7蛋白序列比对Fig.5 Amino acid sequence alignment of COSTIN and CAX7.注：红线标记表示α-1和α-2保守结构域位置。(彩图见图版二)

图6 COSTIN基因的表达模式Fig.6 The expression pattern of COSTIN.

2.6 costin突变体中赤霉素合成途径关键基因的表达检测

鉴于外施GA3可以恢复costin突变体植株矮化的表型，说明其内源赤霉素的含量较野生型低，因此，我们检测了costin突变体中赤霉素合成途径关键基因的表达量(图8)。结果表明，与野生型相比，costin突变体中MtCPS、MtKAO1、MtGA20ox4、MtGA20ox7和MtGA3ox1的表达量明显降低。上述结果表明costin突变体中赤霉素合成途径的关键基因表达量下降，由此导致costin突变体植株矮化的表型。

3 讨论

享有“牧草之王”美誉的紫花苜蓿是世界上应用最广、经济价值最高和栽培面积最大的一种优质豆科饲料作物，苜蓿的产量和品质改良是饲料业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。

图7 costin突变体植株外施赤霉素处理Fig.7 The phenotype of wild type and costin after spraying GA3. A：未喷施GA3的野生型；B：未喷施GA3的costin突变体；C：喷施2 mmol/L GA3的野生型；D：喷施2 mmol/L GA3的costin突变体。(Bars=1 cm) (彩图见图版三)

图8 野生型和costin突变体中赤霉素合成通路关键基因的表达比较分析Fig.8 The expression level of marker genes in gibberellin pathway of the wild-type and costin plants.注： *表示与野生型相比差异显著(t测验，P<0.05)，**表示与野生型相比差异极显著(P<0.01)，每个实验设置3次重复。

株高是决定苜蓿草产量的重要农艺性状，研究结果表明，苜蓿鲜草产量与株高呈正相关关系[14]，但目前关于苜蓿等豆科牧草株高性状的遗传调控机制还有待深入研究。本研究利用豆科模式牧草蒺藜苜蓿为实验材料，通过对矮生突变体costin的初步研究，发现在costin突变体中GA合成途径关键基因表达水平显著下调，同时外施赤霉素GA3可以恢复costin突变体的矮化表型，表明costin突变体的矮化表型是由植物激素赤霉素合成缺失所导致。植物激素赤霉素(GA)是调控植物株高的重要植物激素，具有促进细胞伸长的作用，从而使植株增高[15]，农业生产上第一次“绿色革命”就是利用农作物本身的赤霉素合成和信号转导缺陷所产生的矮化植株来培育抗倒伏农作物新品种，从而大幅度提高了农作物的产量。本研究进一步表明植物激素赤霉素在苜蓿等豆科牧草的株高发育过程中同样存在保守的调控机制。

钙是植物必须的营养元素，同时也是植物体内转导多种生理过程的重要信号物质[16]。已有研究发现植物细胞壁里的钙离子具有降低细胞壁伸展性的作用，而赤霉素能使细胞壁里的钙离子进入细胞质中，使细胞壁的钙水平下降，进而增强细胞壁的伸展性，导致细胞生长加快，从而使植物体的高度增加[17]。COSTIN基因编码一个钙离子转运蛋白，可能参与蒺藜苜蓿体内的钙离子转运过程。尽管目前关于蒺藜苜蓿钙转运蛋白COSTIN与钙离子信号转导以及植物激素赤霉素之间具体的调控机制仍然未知，但本研究为阐明高等植物株高性状形成的分子调控网络和苜蓿株高性状遗传改良提供了新的研究思路。

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