十二井穴放血对不同程度颅脑创伤大鼠脑水肿及线粒体生物合成的影响*

沈彤，张赛，涂悦，陈旭义，吴焕成

[1.天津中医药大学第一附属医院 推拿科，天津 300193；2.武警后勤学院

附属医院脑科中心（天津市神经创伤修复重点实验室），天津 300162；3.天津市北辰医院 脑系科，天津 300400]

随着社会经济、交通运输业等的快速发展，颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）的发生率也逐年增高，其高致残率和致死率给社会和家庭可造成严重负担。而TBI后的继发性脑水肿是导致患者残疾和死亡的重要原因之一，因此有效控制脑水肿是治疗TBI的关键手段[1]。近年有研究显示，十二井穴放血对改善TBI后脑水肿有一定疗效，但相关机制尚不明确。线粒体是机体能量代谢的重要场所，线粒体功能障碍与细胞毒性脑水肿以及神经功能损伤程度密切相关，这提示线粒体或许是井穴放血疗法发挥脑保护作用的重要靶点之一[2-4]。本实验拟通过皮质撞击致伤（controlled cortical impact injury，CCI）构建不同损伤程度TBI大鼠模型，探讨井穴放血疗法对脑水肿的影响，并进一步检测线粒体生物合成相关基因表达以及线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数的变化，从而为研究井穴放血疗法治疗TBI的机制提供更多基础支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雄性SD大鼠56只，7～8周龄，体重220～250 g，购自军事医学科学院动物实验中心。RNA/DNA共提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），实时荧光定量PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

电子控制性脑皮质撞击仪（eCCI，美国Custom &Design公司），Nano Drop 2000（美国Thermo Fisher Scientific公司），real-time PCR仪（Step One Plus，美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及TBI模型的复制将大鼠按随机数字表法随机等分为7组，即轻度TBI组（L组）、轻度TBI加井穴放血组（L+B组）、中度TBI组（M组）、中度TBI加井穴放血组（M+B组）、重度TBI组（H组）、重度TBI加井穴放血组（H+B组）和对照组，每组8只。各TBI组经1%戊巴比妥钠按40 mg/kg麻醉后，暴露右侧顶骨，颅钻钻孔直径约4.5 mm，调整eCCI打击臂至与垂直方向呈20°夹角，使用3 mm直径打击帽打击大脑皮质。参数如下：打击速率为5 m/s，打击后最低点持续时间为0.2 s，轻度、中度、重度TBI组的打击深度分别为1、3和4 mm[5]。对照组仅开骨窗后缝合皮肤，不进行打击。

1.3.2 十二井穴放血用1 ml注射器针头于大鼠双侧前肢趾端的十二井穴点刺出血，出血量为每穴10 μl，每12 h进行1次放血，穴位定位方法采用比较解剖学，参考人体相应穴位解剖标志。

1.3.3 神经功能损伤评分及标本采集7组大鼠均于术后第72 h行mNSS评分[6]，分数越高说明症状越严重，最严重为18分，0分为正常。评价完成后采用颈椎离断法处死大鼠，各组均取损伤灶周边同一部位脑皮质约10 mg，进行后续DNA和RNA的提取，剩余脑组织进行干湿比重测量。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定相关基因表达及线粒体DNA拷贝数按照说明书，提取脑组织的基因组DNA和总RNA，并将RNA逆转录成cDNA。qRT-PCR测定线粒体生物合成相关基因的表达变化，包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1alpha，PGC-1α）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），以及可代表mtDNA拷贝数的线粒体单拷贝基因环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）。方法如下：配制PCR反应体系，包括2×Ultra SYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因组DNA 50 ng，以及相应体积的引物和灭菌双蒸水，每个基因设置3个重复孔。反应条件采用两步法：95℃10 min预变性，随后95℃变性15 s，60℃退火延伸60 s，共40个循环测定Ct值，以0.3℃梯度逐步升温行熔解曲线分析。应用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.3.5 脑组织含水量测定取脑后仅保留左右大脑半球，立即称重，所得质量为湿重。随后将大脑放入烘箱中，75℃烘烤48 h，称重后所得质量为干重。含水量=（湿重-干重）/湿重。

表1 设计引物序列

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能损伤评分

TBI后大鼠的mNSS评分均高于对照组，且随着TBI严重程度的增加，评分依次增高（P＜0.05），且轻、中度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后mNSS评分与相应的L和M组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同组别各指标比较 （n =8，±s）

表2 不同组别各指标比较 （n =8，±s）

组别 mNSS评分/分 PGC-1α TFAM mtDNA拷贝数 脑组织含水量L 组 5.75±1.751） 2.56±0.711） 2.40±0.971） 5.50±1.421） 0.788±0.0161）L+B 组 4.00±1.191）2） 3.13±0.871） 3.07±0.721） 7.82±3.201）2） 0.776±0.0121）M组 8.88±1.731） 2.49±0.781） 2.76±1.351） 5.03±3.361） 0.791±0.0091）M+B 组 6.63±2.131）2） 3.74±1.011）2） 3.41±1.481） 7.42±2.901）2） 0.780±0.0071）2）H组 10.63±2.071） 4.61±2.041） 3.64±0.711） 3.67±1.821） 0.797±0.0121）H+B 组 10.00±1.201） 5.47±1.951） 4.48±2.321） 4.00±1.831） 0.799±0.0151）

续表2

2.2 各基因表达及mtDNA拷贝数变化

TBI模型大鼠的PGC-1α和TFAM基因表达水平以及mtDNA拷贝数均高于对照组（P＜0.001）；轻度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后，mtDNA拷贝数高于相应的未应用放血疗法的大鼠（P＜0.05），中度TBI组大鼠在应用放血疗法后PGC-1α基因表达水平和mtDNA拷贝数升高（P＜0.05），轻、重度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后，虽然PGC-1α和TFAM基因表达水平均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 脑组织含水量

TBI后各组大鼠脑组织含水量与对照组比较均增加，且中度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后脑组织含水量与相应的M组比较降低（P＜0.05），见表2。

3 讨论

脑水肿TBI后常见的并发症之一，常于发病后第2天达到高峰，主要由创伤造成的脑组织缺血、缺氧以及Na+-K+离子泵的功能障碍导致细胞水肿引起，其可造成颅内压急剧增高，从而进一步使脑的血液灌注减少，病情加重，甚至导致脑疝威胁生命[7]。井穴位于人体的四肢末端，是十二经脉气血起始之处，《医宗金鉴-刺灸心法要诀》中指出：“商阳主刺卒中风，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中冲、关冲、少泽、商阳，使气血流行，乃起死回生救急之妙穴”。放血疗法最早的记载可见于《黄帝内经》，如“刺络者，刺小络之血脉也”；“菀陈则除之，出恶血也”，并明确地提出刺络放血可以治疗癫狂、头痛、暴喑、热喘及衄血等病证，与单纯灸法比较，起除淤效果更佳。

本实验结果表明，井穴放血可有效减轻轻度和中度TBI大鼠神经功能损伤症状，并降低TBI后脑水肿的严重程度，提示TBI后应用井穴放血疗法可发挥脑保护作用。与苗笑梅和张静莎等的研究结果类似，苗笑梅等[8]发现，十二井穴刺络放血可以降低神经功能缺陷评分，减轻脑水肿，对创伤性大鼠脑组织有保护作用，张静莎等[9]也发现，手十二井穴放血有改善重型颅脑创伤患者意识状态的作用趋势，但上述两项研究均未深入探讨相关机制。细胞内线粒体可通过氧化磷酸化为细胞活动提供能量，当创伤导致线粒体功能障碍时，可引起细胞内乳酸堆积并影响Na+-H+交换，促进脑水肿的发生[10]。为此本课题组进而检测脑组织中线粒体生物合成相关基因表达及mtDNA拷贝数的变化，以期探索井穴放血疗法发挥脑保护作用的靶点。

结果表明，TBI后组织中mtDNA拷贝数增加，提示创伤在造成线粒体损伤后，mtDNA发生代偿性扩增。一方面，mtDNA是独立存在于细胞器中的环状基因组DNA，其在基因组之中的个数称为mtDNA拷贝数，由于线粒体DNA缺少组蛋白的保护，使其容易受到氧化应激、炎症等危险因素的损害，造成及线粒体功能障碍[11-12]，TBI后，损伤本身及坏死的脑组织可诱导活性氧族（ROS）及炎症因子的释放增多[13]，使机体进入氧化应激状态从而造成mtDNA损伤。另一方面，ROS在造成DNA损伤的同时，本身亦可以作为第二信使，触发TFAM和NRF的表达，促进线粒体扩增，从而降低功能障碍mtDNA所占比例，代偿能量供应水平的下降[14-15]。当应用井穴放血后，可见大鼠的PGC-1α基因以及下游的TFAM基因表达进一步升高，且mtDNA拷贝数提高，表明井穴放血可能是通过激活PGC及下游通路，促进mtDNA的生物合成，从而增强创伤脑组织的能量供应，改善脑水肿程度，发挥脑保护作用。同时，本实验还发现，对于重度TBI大鼠，单独应用井穴放血疗法时，虽然可一定程度上促进mtDNA拷贝数的增加，但并未改善神经功能损伤症状及脑水肿程度，这可能是由于重型TBI因损伤严重，会同时累及多条通路，多因素综合作用导致脑水肿的发生，而单独应用井穴放血疗法尚不足以展现改善脑水肿的作用，提示在重型TBI时应多种治疗策略共同施治，辅以井穴放血疗法，或许能展现出更好的治疗效果。

综上所述，本实验通过构建TBI大鼠模型，初步探讨井穴放血对脑水肿及线粒体生物合成基因的影响，为解释井穴放血发挥脑保护作用的机制提供基础研究。但TBI的发病是多因素共同造成，其发生发展也涉及其他多条通路及靶基因，这仍有待挖掘。若能进一步探讨井穴放血对其他通路的影响，或许可为TBI的临床治疗乃至开发井穴放血的新用途提供帮助。

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