高密度发酵乳酸菌抗冻性影响因素分析

严涛，朱建国，姜甜，陈珂可，方曙光

（江苏微康生物科技有限公司 江苏苏州 215200）

乳酸菌作为益生菌种类之一，其益生功效被广泛应用于保健食品、医药和食品等行业中。其生产工艺中真空冷冻干燥是其制备工艺中的主要环节之一，其乳酸菌的抗冻性直接影响冻干粉活菌数水平，其冷冻干燥工艺，甚至前期的高密度乳酸菌发酵工艺条件都会影响乳酸菌的抗冻性[1]，而发酵工艺条件对乳酸菌的抗冷冻性的影响很容易被研究学者所忽视[2]。不同种类的乳酸菌，其抗冻能力大小不尽相同，但是其抗冻过程中的相关机理基本是一致的[3]。本文从发酵过程中的培养基组分、培养温度、pH值、保护剂、冻干工艺等因素对乳酸菌抗冻性的影响进行分析，为提高乳酸菌的抗冻性，进而提高其冻干粉活菌数水平提供新的思路。

1 高密度乳酸菌发酵工艺对其抗冻性的影响

1.1 培养基的组分及含量对其抗冻性的影响

培养基的组分中碳氮源是主要的影响因素，它们可以对菌体细胞膜中不饱和脂肪酸的含量产生影响，选择合适的碳源，可以增加细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，而其含量的多少与细胞膜的流动性成正比，因此可以提高菌体细胞膜的流动性，使菌体呈现不同程度的抗冻性，使菌体在冻干后的活菌数得到很大提高[4-8]。培养基中的碳氮源除了会影响乳酸菌细膜中的不饱和脂肪酸含量外，不同种类的氮源及碳源还会使乳酸菌的形态发生改变，改变其菌体对周围环境的抗性。Shao Yuyu 等[9]在常用的乳酸菌（De Man，Rogosa and Sharp，MRS）培养基上，额外添加酵母浸膏，其保加利亚乳杆菌ND02的菌体长度是未添加的2倍，菌体表面积的增加，会增大在冷冻过程中形成的冰晶对菌体细胞膜的机械损伤，进而导致保加利亚乳杆菌大量死亡。不同的碳氮源，会影响乳酸菌的代谢途径，进而产生不同的代谢产物。而有些代谢产物的积累也会对乳酸菌抗冷冻性产生一定的影响[10]。例如在含有蔗糖或果糖的培养基上生长的肠膜明串珠菌，其代谢产物可产生甘露醇，这种代谢产物可以维持乳酸菌在低水分下的活性，而且还能起到抗氧化的作用[11]；同样对于海藻糖，当培养基中没有速效碳源（如葡萄糖）时，其作为培养基成份之一会被乳酸菌作为碳源利用，其代谢产物，如乳酸，反而会使菌体周围环境pH值降低，影响菌体内外的离子平衡，进而使其死亡率增加[12]。另外研究也发现当乳酸菌在含有某些特定碳水化合物的环境中生长时，其经过代谢产生的胞外多糖也能提高乳酸菌的抗冻性[13]。

在培养基中添加钙离子时，其钙离子可与乳酸菌在培养过程中产生的代谢产物乳酸及其它酸进行中和，生成乳酸钙盐，减缓pH值下降的程度，降低因过酸对乳酸菌菌体生长造成影响。冷冻干燥过程中，菌体内由液体状态变为冰晶状态，菌体细胞膜的流动性降低，其钙离子的存在可以使不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值增大，而其比值越大，则乳酸菌的抗冷冻能力越强[14]。另外，也有研究发现大部分乳酸菌为厌氧或兼性厌氧菌，对氧自由基比较敏感，而锰离子的存在能与超氧化物歧化酶结合，稳定其酶的结构，保障酶的催化活性，从而提高其低温不利条件下乳酸菌的活性，对乳酸菌的抗冻性能有一定的促进作用[15]。因此，培养基中添加适当的金属离子，可增加不饱和脂肪酸的含量，提高乳酸菌抗氧性能，进而提升其菌体的抗冻性。添加适量的吐温-80可增加乳球菌和乳杆菌菌体细胞膜中的不饱和脂肪酸含量[16]，增加低温状态下细胞膜的流动性，从而提高乳酸菌的抗冻性能。如果培养基中同时添加钙离子与吐温-80，则更能有效提升其菌体的抗冻性能。

以上研究表明，培养基中不同的氮源、碳源对不同菌抗冻性能影响不同，动物来源的氮源可提升菌体的抗冻性，采用合适的氮源、碳源可使菌体产生可保护菌体的抗冻代谢产物，添加海藻糖，需要考虑其被代谢后产酸对菌体的影响，因此其添加量一定要控制在的合理范围内。在乳酸菌的培养基营养成份改变过程中，以发酵液活菌数作为最基本的参考指标，同时更重要的是要考虑在该种培养基下培养得到的乳酸菌对其在后期真空冷冻干燥过程中抗冻性的影响，以得到一个即经济又实用的培养基配方。

1.2 乳酸菌的生长温度对其抗冻性的影响

乳酸菌在高密度发酵时，其生长温度的高低也会影响菌体细胞膜脂肪酸的含量，进而对乳酸菌的抗冻性产生影响。大多数乳酸菌在低于最适温度3℃～5℃时，会提高菌体膜内不饱和脂肪酸C18∶2的含量，其细胞膜的流动性也相应增强，最终提高其抗冷冻能力，但需要把握好温度的变化，不能过低，否则不利于菌体生长[17]。低温还会促进某些乳酸菌多糖合成，从而提高其冷冻干燥存活率[18]。在30、35、37℃分别发酵培养嗜酸乳杆菌RD758与CRL640、棒状乳杆菌Si3及保加利亚乳杆菌L2时，通过比较冷冻前后冻干存活率的情况可知，在30℃发酵培养时其抗冻能力最强，冻干存活率高达67%，相比之前提高30%，而嗜热链球菌在30℃培养所产生的胞外多糖比在37℃的高2倍～5倍，而这种多糖物质对乳酸菌抗冻性有明显的提升作用[18]。因此，适当降低培养温度，可改变膜内不饱和脂肪酸的含量，在冻干时有利于提高细胞膜的流动性；同时还能促进乳酸菌的多糖合成，提升乳酸菌的抗冻性。

1.3 发酵过程中恒定pH值对乳酸菌抗冻性的影响

乳酸菌在发酵过程中pH值的控制也会对其抗冻性产生影响。研究发现不同的乳酸菌（球菌、杆菌等）其发酵pH值对抗冻性有明显区别，研究发现乳球菌在pH值为6.0的发酵培养条件下生长比较适合；而乳杆菌则适合在pH值为5.0的发酵培养条件下生长。主要原因还是不同pH值会增加细胞膜内不饱和脂肪酸的含量，提高菌体细胞膜的流动性，进而提高其抗冻性能[19]；过酸过碱也不利于菌体的生长。另外，也有研究发现[20]不同恒定pH值会对其菌体形态产生影响，保加利亚乳杆菌ND02在发酵培养时，当在恒定pH值由5.7到5.0的普通MRS培养基中生长时，其菌体形态由细长形变成短粗状，而形态呈短粗状时，其冻干存活率优于细长形。因此，针对不同的乳酸菌需控制其相适应的发酵pH值，在相应的发酵pH值条件下培养，可影响菌体膜内脂肪酸的含量，改变菌体形态，进而提升其菌体的抗冻能力。

1.4 发酵过程中的中和剂对乳酸菌抗冻性的影响

乳酸菌在发酵过程中，由于其菌体的生长，影响培养基中pH值变化的代谢产物主要以乳酸为主，当然也有其它酸（如乙酸、甲酸等），其过低的pH值会对乳酸菌的生长产生反馈抑制。因此，在发酵过程中需要通过中和剂来中和酸性物质，维持培养基中pH值的恒定，保证其菌体的最佳生长环境。中和剂一般呈碱性，如碳酸钠、氨水、氢氧化钠等，使用浓度（质量体积比）一般为20%～30%。由于氨水能游离出NH4+，其容易透过细胞壁，刺激菌体生长，提高发酵液活菌数水平，进而提高冻干后菌粉的活菌数水平，比较适合作为酸碱中和剂[21]；但张兴昌等[22]研究嗜热链球菌ND03时，发现采用30%碳酸钠作为中和剂比25%氨水节约20 mL，而且碳酸钠作为中和剂，其与酸中和后，会产生CO2，形成厌氧环境，而乳酸菌基本大部分属于兼性偏厌氧生长，为厌氧乳酸菌的生长创造较适宜的环境。综上所述，乳酸菌在生长时代谢产生的酸使环境pH值降低，从而影响其生长的最佳环境。在生长过程中，添加适当的酸碱中和剂维持恒定的pH值，更有利于维持乳酸菌的生长最佳环境，进而提高冻干后菌粉活菌数水平。

1.5 乳酸菌菌体的收获时期对其抗冻性的影响

乳酸菌在发酵过程中，其菌体生长会经过延滞期、对数期、稳定期及衰亡期。不同的菌体收获期对其活菌数有显著影响。有研究发现菌体在发酵培养达到稳定期初期后经过离心、乳化、冻干收获得到的菌体存活率较对数期中期收获的菌体存活率高8倍[23]。乳酸乳球菌DRC-2与DRC-2C在对数期存活率较低，分别为28.5%和34.7%，而稳定期存活率达到60%和61.2%，提高了 2 倍～3 倍[24]。Rault等[25]在研究时发现保加利亚乳杆菌CFL1在稳定期收获的菌体其抗冷冻性好于其对数期；Ampatzoglou等[26]在研究鼠李糖乳杆菌LGG时发现在稳定期收获的菌体其抗冻性要优于对数期；Louesdon等[27]对长双歧杆菌RO175的研究，也表明稳定时期收获的菌体经过冻干后，其抗冷冻干燥性能要优于对数期。

之所以在稳定期收获的菌体其抗冻性要优于对数期，是因为处在稳定期的菌株因为培养条件的改变（低物的累积、pH值的改变等）、营养物质的缺乏，使其菌体生长与死亡处于一种动态平衡状态，从而诱导菌体产生一系列适应环境的应激反应，提高了其对不良环境的抗性[28]，如稳定期时其细胞膜脂类成分（环丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）含量增加）发生改变，从而增强乳酸菌的抗冷冻干燥能力[29-30]。另外在稳定期时，其乳酸菌的应激蛋白的表达水平、细胞壁的结构上也发生了剧烈变化，导致其对冷冻干燥等不利条件的抗性增加[31]。当然也有例外，如袁杰利等[32]分别对处在对数期和稳定期收获的布氏乳杆菌R1102进行抗冷冻干燥存活试验时，结果发现二者之间没有显著性差异，可能是不同菌株之间发酵培养的差异所造成的[33]。综上所述，处在稳定生长期的乳酸菌其抗冷冻干燥性能要强于其他生长时期阶段，同时也要考虑到菌株间的差异性。

1.6 高密度发酵乳酸菌结束后的处理对其抗冻性的影响

乳酸菌发酵结束后，可通过调整发酵液pH值、添加特定物质等方式来提高其抗冻性。有研究发现将嗜热链球菌ND03发酵终点的pH值由5.8调至6.6，离心、乳化、冻干后所得到的菌体存活率大大提升[34]。张中青等[35]研究发现在发酵结束后的保加利亚乳杆菌ATCC11842的发酵液中添加灭菌过的2%（质量体积比）氯化钠溶液，37℃，100 r/min条件下培养2 h后，收集菌体与保护剂进行乳化、冷冻干燥后，其冻干存活率达到65%，是未处理的1.43倍。究其原因是氯化钠的刺激，改变了细胞内辅因子水平，使菌体胞内磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）活性增加了31.4%，提高酶的活性，将冷冻干燥对乳酸菌带来的损伤降至最低，从而提高乳酸菌的冻干存活率[36]。因此，发酵结束后，通过对发酵pH值的调整，或添加特定物质，有利于提高菌体产酸活力水平，间接提高某些激酶的活性，进而提高菌体的冻干存活率。

2 高密度乳酸菌发酵保护剂/冻干对乳酸菌的抗冻性的影响

2.1 保护剂对乳酸菌的抗冻性的影响

冻干保护剂对乳酸菌的冻干存活率有着直接的影响，因此乳酸菌的菌泥在冻干前与适当的保护剂乳化混合后冻干，可提高乳酸菌的存活率。保护剂的作用效果与其化学结构、分子量大小密切相关。在冷冻干燥和保存中，不同的物质如糖类（蔗糖、乳糖和海藻糖）、蛋白质化合物（脱脂牛奶）、氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）和抗氧化剂（抗坏血酸）已被作为保护剂来提高乳酸菌的存活率[37]。冻干保护剂大致可分为两种：一是小分子量化合物。如氨基酸类、有机酸、低分子的糖类和糖醇类等，这些小分子物质都能透过乳酸菌的细胞膜进入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，冷冻时可减少对菌体的伤害；二是大分子物质。如蛋白质、多糖、聚乙烯吡咯烷酮和其他的合成聚合物等[38]，这些大分子物质不能穿透乳酸菌细胞膜，由于其具有较强的亲水特性和氢键形成能力，其附着在菌体表面，形成稳定的水分子层，阻止细胞膜内结合水向外转移，保护了菌体细胞结构。不同的保护剂物质种类搭配，可减少冷冻干燥对菌体的损伤，提高菌体的抗冻性，进而对乳酸菌的冻干存活率有显著提升，在保护剂中，碳水化合物类、氨基酸类、肽和蛋白质类应用的最多。从目前的研究看，对乳酸菌菌体的冻干脱水方面具有显著保护作用的是碳水化合物类保护剂。其作用机理在于抑制膜脂的相变，即在乳酸菌菌体在冻干升华干燥脱水时，进行“水置换”作用，使得在有碳水化合物保护剂存在的条件下，其干燥膜脂状态与未脱水前生理特征相似[39]，从而稳定其菌体细胞结构，提高冻干后菌体的存活率；脱脂牛奶中包含一个混合的大分子（乳清蛋白和酪蛋白）和糖类，脱脂牛奶可使冻干产品形成多孔结构，更易再水合；在细胞膜脱水后，这些糖类物质代替了结合水，防止蛋白质通过氢键的显露或集聚[40]，为乳酸菌提供良好的保护，故其可作为许多乳酸菌的保护剂[41]；脱脂乳可以通过稳定细胞膜成分防止细胞损伤，提供了细胞蛋白保护层[42-43]。而各种保护剂搭配使用优于单独使用，需要将大分子和小分子物质结合起来使用，才能更好的发挥其保护效果。

2.2 预冷冻速率对其抗冻性的影响

在冻干过程中，其冻干工艺，如预冷速率等也会影响菌体的冻干存活率。其中缓慢冷冻可以增加乳酸菌的抗冻性。原因是经过预冷处理的乳酸菌，其菌体受低温刺激，可诱导其产生冷应激蛋白，提高相关酶的低温活性；此外，低温会使菌体细胞膜上的饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转变，增加菌体在低温下细胞膜的流动性。这些现象对乳酸菌后期的冷冻干燥抗冻性起着重要的积极保护作用[44]。另外，也有研究表明冻干时，其冷冻速率在5℃/min～180℃/min之间时，冷冻干燥时胞内水分会完全渗出菌体外，菌体内不会出现结晶，乳酸菌存活率较高；当冷冻速率在180℃/min～5 000℃/min之间时，菌体内的水分容易在外渗过程中形成结晶，进而容易对菌体造成机械损伤；当冷冻速率大于5 000℃/min时，胞内水分来不及外渗而迅速形成结晶，细胞存活率会受一定的影响；因此在预冻时，需要根据不同菌体的特性来调整其冷冻速率，以达到最佳冷冻存活率[44]。

3 小结

真空冷冻干燥是乳酸杆菌菌粉制备工艺中的重要环节之一，菌体在冷刺激下会发生一系列改变，例如细胞膜的变化、遗传物质的变化等，本文从发酵工艺、发酵后处理、保护剂及冻干工艺等因素对乳酸菌的抗冻影响进行了分析，其培养基成份、培养基温度、发酵pH值、保护剂及冻干工艺等因素都会对乳酸菌的冻干性能产生影响，针对不同菌株的特性需要采用不同的控制条件，而且不同因素之间也存在一定的联系，把握好各个影响因素之间的关系，也是提高乳酸杆菌抗冻性的关键之一。目前对乳酸菌的抗冻性的研究停留在宏观研究水平（如培养基、温度、pH值等），而微观水平（菌株代谢、菌体与营养物质的交换、菌株的差异性等）研究的还不够深入，乳酸菌的抗冻性是一个很复杂的过程，仍需在今后对其进行更进一步深入的研究。