慢病毒介导的RNA干扰沉默RRS1基因对乳腺癌细胞MCF-7生物学行为的影响

(青岛大学医学院生物化学与分子生物学系，山东 青岛 266021)

乳腺癌发病率逐年提高[1]，并呈年轻化发展的趋势[2]，占女性恶性肿瘤发病率的第一位，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第二位[3]。其治疗手段主要包括手术治疗、放化疗及内分泌治疗等。但是，乳腺癌病因多种多样，如膳食方面，高碳水化合物、高脂肪、高蛋白饮食是乳腺癌发病的高危因素，蔬菜水果等富含膳食纤维和维生素的食物是乳腺癌很好的保护因素[4-10]；适当的运动也会降低乳腺癌的发病风险。近年来，乳腺癌内科治疗中的基因靶向治疗成为临床研究的热点[11]。但乳腺癌相关生物标志物和药物治疗靶点研究尚不足，需要进一步对相关因子进行探讨。本研究根据乳腺癌成对样本信息，通过高通量差异表达基因筛选和生物信息分析，成功筛选出一个新的对乳腺癌有重要作用的基因——核糖体合成调控因子RRS1(Regulator of Ribosome Synthesis 1)基因。为了解分析RRS1在乳腺癌中的作用，本实验采用慢病毒介导的RNA干扰MCF-7细胞中RRS1基因的表达，探讨此基因对MCF-7细胞增殖、凋亡、迁移及周期的影响，为进一步探讨其作用机制与临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HMEC细胞(上海吉尼欧公司)，MCF-7细胞(青岛大学附属医院中心实验室)，胰蛋白酶-EDTA(0.53 mmol/L)消化液、RIPA蛋白提取试剂盒、DMSO、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、MTT及PI试剂(北京索莱宝生物科技有限公司)，RNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，慢病毒转染载体和转染试剂盒(上海吉凯基因公司)，RRS1、β-Actin引物(上海生工生物工程有限公司)，小鼠抗人RRS1单克隆抗体以及小鼠抗人β-Actin单克隆抗体(美国Abcom公司)，Annexin V-APC凋亡试剂盒(Ebioscience美国公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，DMEM/HIGH培养基(美国Hyclone公司)，Trizol RNA提取试剂盒、DAPI试剂(美国Invitrogen公司)，Transwell迁移小室(美国康宁公司)，Caspases-Glo 3/7 Assay试剂(美国Promege公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 细胞用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的饱和湿度培养箱中培养，细胞培养至指数分裂时进行实验。取对数生长期的细胞用胰酶消化，计数后每孔将2.5×105个细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度达到30%时，分别进行转染。

1.2.2Western blot方法检测RRS1在MCF-7与正常乳腺上皮细胞HMEC中的表达 分别培养乳腺癌MCF-7细胞与正常乳腺上皮HMEC细胞，当细胞融合度达90%时，弃掉培养基，分别用PBS洗1次，采用RIPA裂解法提取总蛋白；BCA法测定并调整蛋白的浓度，加入5×Loading buffer后煮沸5 min使蛋白高温变性(变性后可-20 ℃储存)。然后选用120 g/L的SDS-PAGE不连续凝胶系统进行电泳分离，经电转装置将蛋白转移至PVDF膜上。用含50 g/L BSA的TBST封闭液缓慢摇床封闭2 h，然后分别用1∶1 000稀释的鼠抗人RRS1一抗4 ℃孵育过夜，以β-actin作为内参蛋白；TBST洗膜3次，每次10 min；用对应二抗室温孵育2 h；重复TBST洗膜步骤；ECL液按说明书配比并进行显影。

1.2.3siRNA序列设计 针对GenBank中RRS1基因的序列(NM_015169)，根据RNAi序列设计原则，设计出针对目的基因序列的多个RNAi靶点序列，通过软件评估预测，筛选出最佳干扰靶点序列为GCTGCCTTCATTGAGTTTA。两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建，并在正义链3′端添加TTTTT终止信号，反义链5′端添加终止信号互补序列，因此正义链为5′-CCGGCCGCTG-CCTTCATTGAGTTTACTCGAG(loop)TAAAC-TCAATGAAGGCAGCGGTTTTTG-3′;反义链为5′-AATTCAAAAACCGCTGCCTTCATTGAGTTT-ACTCGAG(loop)TAAACTCAATGAAGGCAGC-GG-3′。为了排除载体造成的影响，设置以乱序为核心序列的阴性对照，设计原则同上。将两组RNA分别感染MCF-7细胞，即得到shRRS1实验组和shCtrl阴性对照组MCF-7细胞。

1.2.4慢病毒转染 根据慢病毒转染操作手册预实验，得出对于实验组和对照组细胞的MOI值均为20，最适作用时间为9 h。而后换成添加含体积分数0.10胎牛血清的培养基继续培养，转染48 h后荧光观察GFP表达率，即代表病毒转染率，选取达到90%以上稳定转染的细胞进行后续实验。

1.2.5荧光定量PCR(qPCR)检测细胞mRNA表达水平 将稳定转染的两组细胞用Trizol法分别提取总RNA，测定各组RNA浓度与纯度，反转录合成cDNA，然后进行qPCR。反转录条件为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃暂时保存。合成cDNA后，根据qPCR试剂盒使用说明配制反应体系，为提高特异性，减少引物二聚体和错配等扩增，选用两步法扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，退火时采集荧光信号，进行40个循环。RRS1基因的上游引物5′-CCCTACCGGACACCA-GAGTAA-3′，下游引物5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′。内参基因GAPDH的上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。每个样品设3个复孔，比较两组细胞的相对表达丰度。实验至少重复3次。

1.2.6Western blot方法检测细胞RRS1蛋白的表达水平 将稳定转染后的两组细胞弃掉培养基，分别用PBS洗1次，RIPA裂解法提取总蛋白，方法同1.2.2。

1.2.7MTT法检测细胞的增殖能力 取转染后的两组细胞，消化后接种于96孔板，每组设5个复孔，每孔约4 000个细胞，共铺6个板，每天任取一板采用MTT法测细胞的活力。每个板在培养结束前4 h，每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT试剂，4 h后弃去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，震荡5 min使甲瓒颗粒完全溶解，然后用酶标仪检测波长490 nm处各孔的吸光度值，分别制作两组细胞的生长曲线。

1.2.8细胞周期检测 收集细胞上清液，并将冲洗用的PBS以及消化后的细胞与之合并，1 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入1.5 mL预冷的PBS洗1次。然后加入4 mL预冷的体积分数0.70的乙醇溶液(PBS配制)，轻轻吹打成单细胞悬液，4 ℃固定24 h，1 000 r/min离心5 min。沉淀用PBS洗1次，后1 000 r/min离心5 min。用200 μL PBS和2 μL浓度为20 mg/L的RNase重悬细胞，以37 ℃孵育30 min后，加入500 μL浓度为50 mg/L的PI染液，室温避光孵育30 min。另取一组空管加入PBS 200 μL，将上述细胞悬液用300目尼龙网过滤至此管混匀，采用流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期。

1.2.9DAPI法检测细胞的凋亡情况 将稳定转染后的待检测细胞弃去培养基，用PBS洗1次，加入适量甲醇固定5 min。弃去固定液后用PBS洗1次，加入少量4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，室温放置5 min，吸除染色液，用PBS洗涤3次，每次3 min。荧光观察并拍照。

1.2.10Annexin V-APC单染法检测细胞的凋亡情况 分别接种稳定转染后的两组细胞于6孔板，每组设3个复孔，待细胞融合度达90%时进行凋亡实验。以不加染料的细胞作为空白对照。先收集细胞上清液，胰酶消化细胞后与上清液合并，1 300 r/min离心5 min，弃上清液，以4 ℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀。再用1×binding buffer洗涤细胞沉淀1次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入200 μL1×binding buffer重悬细胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC染色，室温条件下避光15 min后，加入400 μL 1×binding buffer混匀，立即上机检测(一般不超过1 h)。

1.2.11caspase 3/7实验检测细胞凋亡情况 在化学发光专用96孔板中，分别接种两种稳定转染细胞，每孔1×104个细胞，细胞悬液体积为100 μL；同时设置一组不含细胞的空白对照，每孔只加入100 μL完全培养基；每组设3个复孔。然后每孔加入100 μL caspase-Glo反应液，将96孔板置于摇板机上以300～500 r/min的转速轻摇30 min混匀。然后根据细胞状况18～22 ℃室温孵育0.5～3.0 h(以1～2 h为宜)。采用酶标仪检测化学发光信号强度。

1.2.12Transwell实验检测细胞转移情况 取6只Transwell小室置于24孔板中，为了平衡小室，上室在实验前加入100 μL无血清培养基，37 ℃培养箱中放置1 h。胰酶消化稳定转染细胞，计数并调整细胞浓度为1×109个/L，小心除去上室中的培养基，加入100 μL细胞悬液，下室中加入600 μL 含300 g/L FBS的培养基，观察培养26 h后，倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻拭去小室内非转移细胞。甲醇固定15 min，放入结晶紫染色液中染色15 min。用蒸馏水冲洗掉多余的染液，晾干。显微镜下随机选取9个视野，计算每个视野穿过的细胞数，计算平均值。进行数据分析，比较实验组与对照组细胞转移能力的差异。

2 结 果

2.1 乳腺癌细胞MCF-7与乳腺正常细胞HMEC中RRS1蛋白的表达

MCF-7、HMEC中RRS1的蛋白表达水平分别为0.990±0.017、0.304±0.012，两组比较，差异有显著性(t=57.485，P<0.05)。见图1。

图1 MCF-7与HMEC中RRS1蛋白的表达

2.2 敲减后RRS1基因转录与翻译水平检测结果

对照组、实验组RRS1 mRNA表达水平分别为1.083±0.493、0.075±0.065，与对照组相比较，实验组RRS1 mRNA表达水平明显降低(t=3.513，P<0.05)。对照组、实验组RRS1蛋白的表达水分别为1.000±0.079、0.276±0.021，与对照组相比，实验组RRS1蛋白的表达水平明显降低(t=8.890，P<0.05)。见图2。

2.3 细胞增殖能力检测结果

MTT法检测细胞活力结果显示，实验组细胞增殖能力明显低于对照组，且随时间的延长差异性越加显著(t=11.353～36.289，P<0.05)。见表1、图3。

图2 MCF-7细胞中RRS1基因敲降前后蛋白表达水平的变化

a为对照组；b为实验组。

2.4 细胞周期检测结果

实验组、对照组G1期细胞构成比分别为(68.26±1.58)%、(58.56±3.82)%，两组比较差异具有统计学意义(t=-4.063，P<0.05，n=3)；两组细胞G2、S期细胞构成比比较，差异无统计学意义。见图4。

2.5 荧光染色检测细胞凋亡结果

荧光显微镜观察细胞凋亡情况显示，实验组中染色质固缩，出现颗粒物质以及核解体的现象增多，其相对凋亡率为2.207±0.045，对照组为1.000±0.110，两组相比较，差异具有显著性(t=-10.138，P<0.05)。见图5。

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

流式细胞仪检测细胞的凋亡情况显示，实验组细胞凋亡率为(37.13±0.677)%，对照组为(19.57±1.33)%，两组比较，差异具有显著性(t=-11.714，P<0.05)。见图6。

2.7 caspase 3/7实验检测细胞凋亡结果

通过对凋亡信号caspase 3/7的检测，以空白孔为对照，对照组、实验组的相对发光量分别为20 119.67±417.56、38 361.67±1 648.42，实验组caspase 3/7活性相对于对照组明显增加，差异具有显著意义(t=-18.581，P<0.05)。见图7。

a为对照组；b为实验组。

2.8 细胞迁移能力的变化

两组细胞置于Transwell体系26 h后观察结果并拍照。实验组细胞转移比例为0.433±0.069，对照组为1.000±0.084，两组相比较，差异有显著性(t=13.722，P<0.05)。

3 讨 论

表1 两组细胞增殖活力比较

a为对照组；b为实验组。

肿瘤的发生发展与原癌基因的激活和抑癌基因的失活，以及凋亡相关分子的状态有关，表现出细胞持续增殖，凋亡明显减少，恶性肿瘤细胞还伴有高度迁移能力。乳腺癌作为目前全球女性发病率最高，死亡率居第二位的恶性肿瘤，受到全社会广泛关注，乳腺癌治疗不足严重威胁着女性的身心健康。

由于蛋白质是生命的主要承担者，因此肿瘤细胞中蛋白质的供应至关重要。核糖体是蛋白质的主要制造车间，核糖体的完整性与功能性对生命体至关重要。RRS1是在酿酒酵母中发现的一种核糖体合成调控因子，其参与核糖体5S RNP的装配、60S大亚基的成熟以及细胞内的运输过程[12-16]。另外，GAMBE等[17]的研究证明，人宫颈癌HeLa细胞中RRS1在细胞分裂间期定位于核仁，分裂过程中则分散于染色质周围，RRS1敲减的HeLa细胞表现出染色体排列和纺锤体组装异常，导致有丝分裂延迟，即RRS1可能参与细胞有丝分裂过程的染色体行为变化。RRS1还与端粒聚集与沉默以及着丝粒的功能有关[17-19]。然而RRS1与人类疾病关系的研究较少，RRS1突变或缺失会引起相应细胞器的功能异常，如参与亨廷顿病的内质网应激反应[20]，以及线粒体疾病的发生[21]。RRS1与肿瘤关系的研究更少，特别是与乳腺癌发病关系的研究尚未检索到相关文献报道。

a为对照组；b为实验组。

本研究通过对乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织进行成对样本信息高通量筛选检测，发现RRS1在乳腺癌组织中高表达，这提示RRS1与乳腺癌的关系密切。为了鉴定RRS1对调控乳腺癌发生发展的作用，本实验采用了慢病毒载体介导的shRNA干扰乳腺癌MCF-7细胞中RRS1的表达，然后检测MCF-7细胞的增殖、凋亡与迁移能力等改变，进而确定RRS1与乳腺癌的关系。实验结果显示，敲减RRS1后出现G1期细胞阻滞、细胞增殖活力随时间延长而显著降低的情况；同时，分别从细胞凋亡形态学、细胞膜上凋亡指示分子以及凋亡信号通路中的关键分子着手研究，均证明敲降RRS1会使MCF-7细胞凋亡显著增加；并且，Transwell实验证实敲降RRS1表达后，MCF-7细胞的迁移能力也显著降低。最近有关于RRS1与肝癌细胞生长关系的研究结果与本课题结论一致，敲降RRS1表达会抑制SMMC-7721细胞的增殖，凋亡率增加等[22]，进一步证明了RRS1对于肿瘤的促进作用。

a为对照组；b为实验组。

综上所述，RRS1可能在肿瘤中起到原癌基因的作用，可能成为乳腺癌治疗研究中新的分子靶点。接下来我们将探究RRS1对乳腺癌的作用机制，使RRS1能早日更好地应用于乳腺癌临床治疗。

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