植酸不同水解率产物对结直肠癌移植模型肿瘤细胞分化的影响

(青岛大学公共卫生学院，山东 青岛 266021)

目前，结直肠癌在恶性肿瘤中的发病率位居第三位[1]，在全世界癌症死亡率中居第四位[2]。随着人们饮食习惯的改变，结直肠癌发病率呈现上升的趋势。植酸(IP6)是一种天然存在的碳水化合物，存在于高纤维食物(如谷类和豆类)中，其中以豆类植物种子、谷物麸皮和胚芽中含量最高[3-6]。大量的体内和体外实验证明植酸对于多种肿瘤具有抑制作用[7-12]。SAAD等[13]研究显示，植酸不会对正常细胞的生长产生不良影响。临床研究显示，癌症患者在化疗期间接受植酸干预之后，能够很好地改善生活质量[14]。恶性肿瘤的发生与细胞分化失常有关，诱导肿瘤细胞分化成为治疗肿瘤的一种新途径。国外一些学者研究显示，植酸可以通过诱导结直肠癌分化来抑制肿瘤的恶性发展[15]。来源于神经细胞瘤的骨髓细胞瘤病毒相关癌基因(N-MYC)下游相关基因1(NDRG1)是从分化的结直肠癌细胞中分离出来的一种新的基因，在细胞分化中发挥着至关重要的作用。NDRG1能够诱导肿瘤分化[16-17]，抑制肿瘤转移[18-19]。膳食中的植酸进入人体后，在肠道菌群酶的作用下，能水解成植酸水解产物，而植酸水解产物也具有抗癌活性，能够抑制结直肠癌细胞生长[20]。我们课题组前期研究显示，100 mg/L的30%和90%植酸水解率产物对CT-26细胞的增殖抑制效果较植酸明显。本研究以此为基础，通过建立结直肠癌移植瘤小鼠模型，研究植酸及其水解产物对NDRG1蛋白表达的影响，探讨植酸水解产物与植酸产生的效果之间的差异，并进一步探讨其诱导肿瘤分化的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及细胞培养

小鼠结肠腺癌细胞株CT-26购买自中国科学院上海细胞库。将CT-26细胞置于含有体积分数为0.15的胎牛血清以及青链霉素(青霉素的浓度为100 kU/L，链霉素浓度为0.1 g/L)的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、含体积分数0.05的CO2恒温培养箱中培养。

1.2 动物及饲养

雄性BALB/c小鼠28只，6～8周龄，体质量18～22 g(山东鲁抗医药股份有限公司)。在SPF条件下，在平均温度(24±2)℃，平均湿度(52±8)%环境下适应性喂养7 d，食用饲料，自由饮水。

1.3 试剂

植酸钠购于北京华迈科公司(纯度≥98%)；30%和90%植酸水解率产物为实验室制备。Wes-tern blot相关试剂购买于碧云天生物技术公司。NDRG1抗体购于英国Abcam公司，N-MYC抗体、同源磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)抗体、β-actin抗体购于美国Proteintech Group生物技术有限公司。

1.4 小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型制备及分组

将含有5×109个/L细胞的CT-26细胞悬液注射到小鼠右侧背部皮下，每只注射0.1 mL。待生长至2周且肿瘤体积达到1 cm×1 cm大小时造模成功，将造模成功的28只小鼠按照肿瘤结节大小进行随机区组分组，分为生理盐水组(A组)、30%植酸水解率产物组(B组)、90%植酸水解率产物组(C组)及植酸组(D组)4组，每组7只小鼠。分组后第2天，小鼠分别给予生理盐水及浓度为100 mg/L的30%植酸水解率产物、90%植酸水解率产物和植酸，进行瘤体四周多点注射，每次注射0.1 mL，每周2次，连续注射10周。

1.5 肿瘤体积计算及病理学观察

在药物干预期间，每周测量并记录瘤块大小。于末次注射药物后12 h(禁食禁水)，处死小鼠。摘除小鼠背部的肿瘤，测量肿瘤体积。用多聚甲醛固定，制作石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色后进行病理学观察。计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(%)=(对照组平均肿瘤体积-实验组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积×100%

1.6 Western blot方法检测肿瘤组织内N-MYC、NDRG1、PTEN蛋白表达情况

取约50～100 mg肿瘤组织，用无菌手术剪将组织剪成细小的碎片，然后加入含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，提取肿瘤组织的总蛋白。用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度。测定完成后向各组蛋白中加入上样缓冲液，混匀，然后加热，使蛋白变性。蛋白冷却后加入到SDS-PAGE凝胶上电泳分离，将分离后的蛋白分子转移至PVDF膜上。再用含脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后重新加入二抗孵育2 h。加入ECL发光液放入FusionFX5显影仪中显影，得到目的蛋白条带。以目的蛋白与内参灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。实验重复3次，结果取均值。

2 结 果

2.1 各组小鼠的一般情况

小鼠接种CT-26细胞后，C组和D组的小鼠精神状态良好，行动均自如。A、B、C、D组分别有6、7、7、7只小鼠存活至实验结束。A组1只小鼠死于药物干预期间，可能是与肿瘤体积较大，肿瘤处发生溃烂而引起的。B、C、D组小鼠的肿瘤抑制率分别为26.8%、56.73%、43.21%，C组小鼠的抑制率高于D组。

2.2 各组小鼠肿瘤抑制情况

A、B、C、D组小鼠的肿瘤体积分别为(10.71±1.34)、(8.24±0.46)、(4.75±0.80)、(6.67±1.96)cm3，A组的小鼠肿瘤体积较大，个别肿瘤组织内出现糜烂坏死结构；B组小鼠肿瘤体积与A组相比差异无统计学意义(P>0.05)；与A组相比，C组及D组肿瘤组织体积相对较小且未出现糜烂坏死结构，差异具有统计学意义(F=23.13，P<0.05)；C组小鼠肿瘤体积明显小于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组小鼠肿瘤组织病理检查结果

A组与B组小鼠肿瘤组织内细胞紧密，排列混乱，细胞核深染，核质比增大。D、C组小鼠肿瘤组织内细胞排列相对整齐，核染色较浅(图1)。

1、2、3、4分别为A、B、C、D组，HE染色，200倍。

图1各组小鼠肿瘤组织免疫组织化学观察结果

2.4 各组小鼠移植瘤组织中NDRG1、N-MYC和PTEN蛋白的表达

与A组相比，C组和D组N-MYC蛋白的表达水平降低(F=30.65，P<0.05)，NDRG1和PTEN蛋白的表达水平明显升高，差异有统计学意义(F=20.73、14.69，P<0.05)；C组的效果优于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表1。

图2各组小鼠移植瘤组织中NDRG1、N-MYC和PTEN蛋白的表达情况

组别N⁃MYCNDRG1PTENA组1．38±0．220．50±0．090．53±0．11B组1．24±0．110．59±0．110．80±0．10C组0．46±0．051．53±0．301．30±0．22D组0．74±0．110．91±0．110．85±0．12

3 讨 论

植酸的水解产物由多种次级磷酸化形式组成，包括五磷酸肌醇、四磷酸肌醇、三磷酸肌醇、二磷酸肌醇、一磷酸肌醇以及肌醇，付余英[21]研究显示，当植酸水解率达到83%和100%时，植酸水解产物主要为一磷酸肌醇和肌醇。肌醇也可以发挥温和的抗肿瘤作用。国外研究显示，肌醇能够有效地降低乳腺癌细胞分化和传播速度[22-23]。国内研究显示，植酸和肌醇联用能够对结直肠癌发挥更好的抑制作用[24-25]，因此我们认为90%水解率时的主要产物是肌醇，它可以与植酸联合发挥抗肿瘤作用，抑制结直肠癌生长。我们课题组的前期研究显示，100 mg/L的90%水解率产物对CT-26细胞的抑制效果相对植酸较明显[20]。前期关于植酸水解产物的研究主要集中在工业方面，而将其用于动物实验的研究却较少[26-27]。本研究以此为基础，进行动物实验，建立BALB/c小鼠结直肠癌移植瘤模型，显示C组和D组小鼠肿瘤体积相比A组明显减小，这表明90%水解率产物和植酸均能抑制肿瘤的生长，并且90%水解率产物的效果优于植酸，这与我们前期的研究结果相一致。

肿瘤的发生与细胞分化失调有关，细胞分化的调控，受到多因素多方面的影响。在对植酸及其水解产物诱导结直肠癌分化机制的研究中，本研究观测了植酸及其水解产物对分化相关因子NDRG1、N-MYC以及PTEN表达的调控。结果显示，A组中小鼠NDRG1蛋白表达水平较低，C组和D组的NDRG1蛋白表达水平明显高于对照组，这表明植酸及其水解产物可以通过上调NDRG1蛋白表达，诱导结直肠癌细胞分化，抑制肿瘤的生长及发展。NDRG1基因的表达会受到较多种因素的影响。NDRG1是N-MYC的下游基因，受到N-MYC的调控[28-29]，本研究结果显示，A组小鼠N-MYC蛋白的表达水平明显上升，且NDRG1蛋白水平呈低表达，肿瘤体积增长速度较快。这表明90%水解率产物可以抑制N-MYC蛋白的积累，从而促进其下游NDRG1的表达，诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，逆转其恶性表型，抑制肿瘤发展。国外一些学者证实，PTEN和NDRG1的表达具有显著的相关性[30-31]。本研究结果显示，植酸及其水解产物组的PTEN蛋白表达水平高于对照组，这表明植酸及其水解产物上调了PTEN的表达，增强了NDRG1的表达水平，诱导肿瘤细胞分化，进而抑制肿瘤生长。

综上所述，本研究建立了结直肠癌移植瘤小鼠模型，显示30%和90%植酸水解产物能够诱导结直肠癌分化，通过对分化相关因子NDRG1、N-MYC以及PTEN的进一步研究显示，植酸及其水解产物能够提高NDRG1和PTEN蛋白的表达水平，降低N-MYC蛋白的表达水平，诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，且90%植酸水解产物抑制肿瘤的效果优于植酸。植酸不同水解率产物抗肿瘤作用及其机制的进一步研究，对于癌症的防治具有重要意义，但其诱导结肠癌分化的具体作用机制有待进一步的观察。

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