副干酪乳酸杆菌所产抑菌物质的特性研究

佳木泰，林晓龙，吴敬，郭海燕，芒来,道楞

（内蒙古农业大学a.动物科学学院；b.食品科学学院，呼和浩特010018）

0　引言

通过近些年研究，干酪乳杆菌划分出新种，即副干酪乳杆菌（L.paracasei）。L.paracasei耐酸、N aC l及胆汁盐，并具抗过敏作用[1]。其被划分为干酪乳杆菌菌群[2]。

乳酸菌产的乳酸、乙酸、CO2、H2O2、细菌素等具有抑菌活性[3-4]。J Lozo报道L.paracasei BGBUK 2-16能产生具有抑菌作用的细菌素[5]。M.Atanassova也提出L.paracasei subsp M 3可产抑制细菌、真菌的物质，鉴定为类细菌素[6]。高莹等得出L.paracasei HD 1.7对B.subtilis的作用方式为抑菌[7]。滕志利提出L.plantarumA8对Escherichia coli的作用方式为杀菌[8]。Caridi A等人发现Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei BGBUK 2-16所产抑菌物质可低温储存[9]。因此L.paracasei所产细菌素有望成为食品防腐剂。

本研究筛选分离自内蒙古传统乳制品中的乳酸杆菌，得到副干酪乳杆菌Q-1-4，并对其进行生理生化和分子生物学鉴定，确定所产抗菌物质的性质，为开发具有新型生物防腐剂功能的细菌，细菌素奠定了基础。

1　实验

1.1　菌株

由内蒙古牧区家庭以传统发酵法制作的酸马奶样品中分离了本实验所需的8株乳酸菌。不同类型的指示菌—革兰氏阴性菌4株、革兰氏阳性菌7株。以上菌株均由内蒙古农业大学食品科学与工程学院食品生物技术团队提供。

1.2　培养基

以参考文献[10-11]备注的培养基配制方法为参考。

1.3　试剂

过氧化氢酶(2 000～5 000 U/mg)购于美国Sigm a公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶(250 U/mg)购于北京Amersco公司；木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）、蛋白酶K(40 m Ansom U/mg)；细菌基因组DNA提取试剂盒；其他化学试剂：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、氯仿；吐温 20、吐温 80、Tx-100、SDS、EDTA、尿素；硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁、氯化钡、氯化钙均为国产分析纯。

1.4　仪器

HPS-250生化培养箱；PB-10 pH计；BCN-1360型生物超净工作台；CP1502C电子天平；PCR仪；RE-52CS-1旋转蒸发仪；KDC-140HR高速冷冻离心机。

1.5　方法

1.5.1乳酸菌的活化以及无细胞上清液的制备

将半固体穿刺保藏好的试验菌株接种于5 mL的M RS液体培养基中，放置培养箱里37℃培养24 h，按2%的接种量活菌传3代，将最后一代液体培养物在离心机中以转速为6 000 r／min的速率离心15 min（4℃）后，用旋转蒸发仪将上清液浓缩10倍，0.45μm孔径的滤菌器过滤除菌，得到CFS，置于4℃保存备用[13]。

1.5.2指示菌菌悬液的制备

将保存的指示菌挑单菌落接入LB液体培养基中，37℃培养24 h后，以2%的接种量再活化2代，第3代培养24 h后。用0.85%无菌生理盐水梯度稀释至菌悬液浓度为106mL-1，4℃保存待用。

1.5.3抑菌活性的测定

采用双层琼脂平板扩散法检测待检菌中是否具有抑菌活性[14]，采用双层琼脂平板扩散法，以枯草芽孢杆菌（B.subtilis CGMCC 1（B）63501）为指示菌进行抑菌实验。

1.5.4产抑菌活性物质的乳酸菌筛选

1.5.5产抑菌物质乳酸菌的鉴定

采用常规的形态学、生理生化鉴定及16S rRNA序列分析进行种属的鉴定。

（1）菌体形态和生理生化鉴定。将半固体保存的试验菌株接种到MRS液体培养基中，传两代。在固体培养基上划线37℃培养48 h后，观察菌落形态及菌体形态。

通过形态观察，对筛选出的乳酸菌菌株做常规的生理生化试验：过氧化氢酶试验、葡萄糖产气试验、发育温度试验（15℃、45℃生长）和糖发酵试验等。根据《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》[15]和《常见细菌系作用的乳酸菌基因组总DNA，并以此DNA为模板，利用细菌rDNA引物进行PCR扩增[17]，用于扩增的引物为一对通用引物，正向引物为27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′，反向引物为1495r：5′，-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR的反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃复性1 min，72℃延伸2 min，30次循环，最后72℃延伸5 min。将PCR产物回收后进行测序。将获取的序列结果与GenBank数据库中的相关种属的序列进行比对，利用DNAStar软件构建其系统发育树，并进行系统发育树分析。

1.5.6L.paracasei Q-1-4产抑菌物质的确定

（1）酸及酸性末端产物作用的排除。为排除酸性末端产物的干扰，将浓缩10倍的无细胞发酵上清液pH调至5.0和5.5，采用调配成相同pH值的乳酸和乙酸为对照，进行抑菌试验。

（2）过氧化氢的检测与排除。由浓度为50 mm o l/L的磷酸缓冲液（pH=7.0）溶解过氧化氢酶配成母液，按终质量浓度为1 mg/mL加入到排酸后的CFS中，37℃温浴2 h取出后在水浴箱100℃煮沸5 min使酶灭活，再调至排酸pH后进行抑菌试验。

（3）蛋白酶对抑菌物质活性的影响。将各酶溶解在pH=7.0的磷酸缓冲液中配成母液(胃蛋白酶溶解在pH 2.0的磷酸缓冲液中)，将5份等量的CFS的pH调至胰蛋白酶、蛋白酶K、溶菌酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的最适pH(依次为7.6，7.0，6.5，2.0，6.2)，按终质量浓度1.0 mg/mL加入各酶液，37℃温浴2 h后100℃水浴5 min使酶灭活[18]。将pH值调至排酸pH值，以未经酶处理CFS为对照，进行抑菌实验。

1.6　L.paracasei Q-1-4的抑菌动力学曲线

将待测菌株接种于装有MRS液体培养基的试管中37℃恒温培养，每间隔2 h在600 nm波长下测光密度值，共测。以时间为横坐标，光密度值为纵坐标，得到乳酸菌的生长曲线[19]，同时以B.subtilis CGM CC 1（B）63501做指示菌，采用双层琼脂平板扩散法，测定不同培养时间菌株无细胞上清液的抑菌活性。

1.7　L.paracasei Q-1-4所产抑菌物质的特性

1.7.1抑菌物质的pH稳定性

分别用浓度为1 m o l/L的HC l和1 m o l/L的NaOH将该菌的CFS pH值调为2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0；以调配成相同pH值的MRS液体培养基为对照，进行抑菌实验。

1.7.2抑菌物质在不同pH值下的热稳定性

将调至不同pH值的无细胞发酵上清液分别于60，80，105，121℃下处理30min，冰浴急冷后，将未经温度处理的CFS为对照，进行抑菌实验。

1.7.3抑菌物质的紫外线敏感性

取等量的CFS，并将其平铺于灭菌平皿中，输出调至40 W的紫外灯下距离40 cm分别辐照10，30，统鉴定手册》[16]中描述的特征进行分析，确定其菌株归属。

（2）分子生物学鉴定。提取所纯化的具有抑菌120 min，将未经紫外处理的CFS为对照[13]，进行抑菌实验。

1.7.4有机溶剂对抑菌物质的影响

将甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丁醇加入到CFS中，使终质量分数为1.0%。将未经有机溶剂处理的CFS与加入相同有机溶剂浓度处理的M RS液体培养基为对照[20]，进行抑菌试验。

1.7.5表面活性剂对抑菌物质的影响

将Tw een 20、Tw een 80、Tx-100、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素(U rea)加入到CFS中，使终浓度为1.0%。将未经表面活性剂处理的CFS和加入相同表面活性剂浓度处理的M RS液体培养基为对照[21]，进行抑菌实验。

1.7.6金属离子对抑菌物质的影响

将溶解在浓度为50 mm o l/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中的不同金属离子（包括FeSO4，ZnSO4，Cu-SO4，BaC l2，CaC l2，mgSO4）溶液分别按 1:1的体积与CFS混合。将未经金属离子处理但加入相同体积超纯水的CFS和加入相同金属离子浓度处理的M RS液体培养基为对照[22]，进行抑菌实验。

1.7.7抑菌物质保藏的稳定性

将代谢产物分别在常温，4℃和-20℃下储藏0，20，40，60 d；检测不同温度及不同时间的储藏对指示菌抑菌活性的变化[23]。

1.7.8L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质的抑菌谱

将各类革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌活化传3代，第3代的培养菌数进行梯度稀释调至106mL-1，进行抑菌实验。

1.8　数据处理

每个试验三个平行，数据用平均值±标准偏差（SD）表示，用软件SPASS 19.0进行数据分析。

2　结果与讨论

2.1　产抑菌活性物质乳酸菌的筛选

将使用双层琼脂平板扩散法，以革兰氏阳性菌B.subtilisCGMCC 1（B）63501为指示菌，对内蒙古牧区家庭传统手工工艺制作的酸马奶中的8株乳酸杆菌进行抑菌活性菌株筛选，结果见表1。

表1　乳酸菌的抑菌活性

由表1可以看出，8株乳酸杆菌均对指示菌有抑制作用。从中选取抑菌效果较好的Q-1-4进行后续研究。

2.2　产抑菌物质乳酸菌的鉴定

2.2.1菌体形态和生理生化鉴定

将菌株分离纯化后，在MRS固体培养基上37℃培养24 h之后的菌落特征见图1。光学显微镜下菌体形态由图2所示。菌株Q-1-4生理生化鉴定结果如表2所示，呈短杆状，成对或成链状排列，革兰氏染色呈阳性，无芽孢。表中这些生理生化特征与文献[24]中描述得L.paracasei的特征相同，初步鉴定归入副干酪乳杆菌。在公布的乳杆菌属和种的分类中，德国微生物与细胞培养物保藏中心将副干酪乳杆菌直接划分为干酪乳杆菌菌群[2]。由于副干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌以及干酪乳杆菌中的其它亚种具有很高的相似性，需要结合分子生物学试验对其进行鉴定。

菌落特征如图1所示；光学显微镜下菌体形态如图2所示；生理生化鉴定结果如表2所示。

表2　菌株Q-1-4的生理生化特征

图1　乳酸菌Q-1-4的菌落形态特征

图2　乳酸菌Q-1-4的菌体形态（10×100）

2.2.2分子生物学学鉴定

以菌株Q-1-4的DNA为模板，采用16S rDNA引物进行PCR扩增，获得长度为1500 bp的16SrDNA碱基序列。将其与GenBank中已知菌株的基因序列进行同源性比较，结果见表3，系统发育树见图3。

表3　菌株Q-1-4的同源性分析

图3　菌株Q-1-4的系统发育树

由表2和图3可以看出，实验菌株和已知菌的亲缘关系，菌株Q-1-4与L.paracasei同源性高达99.2%，在进化树中处于同一分支，故判定Q-1-4为L.paracasei。将生理生化试验和分子生物学试验相结合，认定菌株Q-1-4为L.paracasei。

2.3　 L.paracasei Q-1-4产抑菌物质的确定

2.3.1酸与过氧化氢作用的排除

由于乳酸菌在代谢中产生的过氧化氢和酸性末端产物也可抑制细菌的生长，故应排除过氧化氢和酸的干扰，结果如表4所示。

表4　酸与过氧化氢作用的排除

由表4可以看出，pH 5.0的乳酸、乙酸对B.subtilisCGMCC1（B）63501没有抑制作用，而 pH 5.0的L.paracaseiQ-1-4产生的CFS对其有明显的抑制作用，说明CFS的抑菌活性不是由有机酸引起的，仍然存在其他的抑菌物质。

经过氧化氢酶处理后的L.paracaseiQ-1-4发酵上清液抑菌能力比未处理的CFS低，但还存在较强的抑菌作用，从而说明乳酸菌发酵上清液中的过氧化氢不是主要的抑菌物质，还存在其它的物质抑制指示菌。

2.3.2蛋白酶对抑菌物质活性的影响

为了确定抑菌物质的性质，用蛋白酶K、溶菌酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理CFS，测定酶处理前后对指示菌B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑菌活性变化，结果如表5所示。

表5　蛋白酶对抑菌物质活性的影响

由表5可以看出，L.paracaseiQ-1-4经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理之后对指示菌B.subtilisCGMCC1（B）63501的抑菌活性显著下降，但仍然具有较强的抑菌作用，而经过溶菌酶处理之后抑菌活性没有变化，说明该抗菌物质中含有蛋白类物质或肽类物质。仍具有抑菌活性的原因可能是菌株Q-1-4所产抑菌物质不仅仅含有蛋白类物质，还有胞外多糖等其他具有抑菌效果的代谢产物。，具体成分有待进一步分析确定[18]。经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理之后抑菌活性下降最大，说明L.paracaseiQ-1-4对胰蛋白酶和胃蛋白酶最敏感，而在人体肠道内又存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，所以在人体内可被消化吸收而无残留，可作为安全放心的食品防腐剂得以应用。

2.4　 L.paracasei Q-1-4的抑菌动力学曲线

图4　 L.paracasei Q-1-4生长曲线及抑菌活性

目前，细菌素产量和抑菌活性强弱通常是通过抑菌圈的直径进行衡量[25-26]。将L.paracaseiQ-1-4 37℃培养60 h，每隔2 h测定OD 600nm、pH值及CFS对B.subtilisCGM CC 1（B）63501抑菌活性，结果见图4。

由图4可以看出，L.paracaseiQ-1-4培养至4 h即进入对数期，12～14 h后进入到稳定期，从整个发酵过程中可以看出，L.paracaseiQ-1-4产酸能力较强，最终pH值稳定在3.9左右。L.paracaseiQ-1-4从对数期前期（6 h）开始，就有了抑菌活性，进入稳定期(12 h)后抑菌物质产量持续增加，稳定期后期(22 h)的抑菌物活性达到最高水平。故选取发酵22 h的发酵液作为后续研究对象。

2.5　 L.paracasei Q-1-4所产抑菌物质的特性

2.5.1pH稳定性

将L.paracaseiQ-1-4产生的CFS的pH值调至2.0～6.0，进行抑菌试验，结果如表7所示。

表7　抑菌物质的pH稳定性 mm

由表7可以看出，L.paracaseiQ-1-4产生的抑菌物质在pH 2.0～5.0时对B.subtilisCGMCC1（B）63501有抑制作用，抑菌活性随pH升高而逐渐降低。当pH＞5.0时，对B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑制作用消失。因此，抑菌物质对B.subtilisCGMCC1（B）63501的有效抑菌pH范围为pH 2.0～5.0。该抑菌物质在强酸条件下抑菌活性较强，这是由于乳酸菌素在低pH值时，乳酸菌对其吸附能力低，这种吸附作用随着pH值降低而增强，因此，该抑菌物质在低pH值时具有较高的抑菌活性，在高pH值时无抑菌活性[27]，所以它适用于偏酸性食品中。

2.5.2热稳定性

将不同pH的CFS分别在60，80，105，121℃下处理30 min，将未经温度处理的CFS作为对照，进行抑菌实验，结果如表8所示。

表8　抑菌物质的热稳定性

由表8可以看出，L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质在同一处理温度，不同pH下，随着pH的升高，抑菌能力逐渐下降，当pH值为2.0时各温度环境下得抑菌圈直径平均为38.44 mm,pH值为5.0时各温度环境下抑菌圈直径减小至平均18.01 mm，平均下降20.43 mm。不同温度环境下的抑菌环直径随pH值升高而缩小的规律相近，且缩小幅度随pH值升高而增加，pH值达到5时抑菌能力明显下降。这可能是由于高pH环境使细菌素的蛋白质结构构象发生了变化[27]，从而导致抑菌活性下降。L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质在同一pH值不同处理温度下，随着处理温度的升高，抑菌活性逐渐降低。但总体来说，降幅不大，各pH值条件下平均下降仅1.65 mm。该抑菌物质对高温表现出了相对良好的耐受性。耐高温是该抑菌物质的有利优点，食品加工高温处理时，其抑菌活性不受影响，故在食品加工中可得到广泛的应用。

2.5.3抑菌物质的紫外线敏感性

将L.paracaseiQ-1-4的CFS在40W的紫外灯下将距离40 cm分别辐照不同时间的抑菌物质活性如表9所示。

表9　抑菌物质对紫外线的敏感性

由表9可以看出，经紫外线辐照不同时间的抑菌物质的抑菌活性与对照组无显著差异，说明，L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质对紫外线不敏感。由于有些食品防腐剂不耐高温高压杀菌，便可以通过紫外杀菌的方式来达到灭菌的目的。该抑菌物质对紫外有耐受性，故在食品防腐剂领域有着巨大的应用潜力。

2.5.4有机溶剂对抑菌物质的影响

L.paracaseiQ-1-4的CFS用甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿处理后进行抑菌试验，结果如表10所示。

由表10可以看出，上述有机溶剂对抑菌物质的抑菌活性没有明显影响，说明该抑菌物质对有机溶剂具有良好的耐受性。

2.5.5表面活性剂对抑菌物质的影响

L.paracaseiQ-1-4的CFS分别用质量体积浓度为 1%的Tween 20、Tween 80、Tx-100、EDTA、SDS、Urea处理后进行抑菌实验，结果如表11所示。

由表11可以看出，经 Tween 20、Tween 80、Tx-100、U rea处理的CFS对抑菌物质的抑菌活性没有明显影响。添加SDS的抑菌物质对B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑制作用明显增强。这可能是由于SDS作为阴离子表面活性剂，通过与蛋白天然结构中的内部疏水区的配位作用使得蛋白结构被打开，从而影响蛋白质的立体结构[28]。L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质与EDTA共同作用效果好于单一作用。对于革兰氏阴性菌，EDTA起到外膜渗透剂的作用，络合掉脂多糖维持其结构所需的钙离子，破坏其结构；对革兰氏阳性菌的抑制作用则主要是由于EDTA与金属离子结合[29]。

表10　有机溶剂对抑菌物质的影响

表11　表面活性剂对抑菌物质的影响

2.5.6金属离子对抑菌物质的影响

将L.paracaseiQ-1-4的CFS与溶解在50 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）不同金属离子（包括FeSO4，ZnSO4，CuSO4，mgSO4，BaC l2，CaC l2）溶液分别按 1:1体积混合。以未经金属离子处理的CFS及相同金属离子浓度处理的M RS液体培养基为对照，进行抑菌实验，结果如表12所示。

表12　金属离子对抑菌物质的影响

由表12可以看出，上述金属离子对抑菌物质的抑菌活性没有明显影响（P＞0.05），说明对上述金属离子有一定的耐受性。

2.6　抑菌物质保藏的稳定性

代谢产物在不同温度下储藏不同时间后对指示菌抑菌活性的变化结果表13。

由表13可以看出L.paracaseiQ-1-4在常温、4℃、-20℃储藏20 d后的CFS对B.subtilisCGMCC 1（B）63501的抑菌活性基本没有明显的变化。

表13　抑菌活性在储藏过程中的变化

由表13可以看出，40 d后，抑菌活性略微降低一点，基本保持稳定。60 d后，其活性均不同程度的降低，其中-20℃的损失最小，具体机理还有待于进一步研究。可见L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质在储藏过程中对冷冻和冷藏有较好的耐受性，所以其在食品保藏方面具有一定的应用潜力。

2.7　 L.paracasei Q-1-4所产抑菌物质的抑菌谱

通过以不同的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌做指示菌，进行抑菌试验，得到L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质的抑菌谱，结果如表14所示。

表14　Q-1-4所产抑菌物质的抑菌谱

由表14可以得出，L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质对所选的指示菌均显示了较强的抑菌活性，其中对S.aureusCM CC（B）26112、E.coliATCC 25922、S.typhim uriumCMCC 50115、B.subtilisCGM CC 1（B）63501等显示了很强的抑菌活性，抑菌圈直径16 mm以上；对B.cerecusCGMCC1.1686、G.stearotherm ophilusGM CC 1.1923等显示了较强的抑菌活性，抑菌圈直径13 mm以上。由此可知，L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质抑菌谱较广，对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，这使得该抑菌物质有着广阔的开发潜力。目前作为防腐剂应用于食品中的N isin也只抑制革兰氏阳性细菌，1999:214-222.对革兰氏阴性细菌、酵母菌抑制效果不好[30]。可见，由L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质在应用前景上比N isin更广阔。

3　结论

通过采用双层琼脂平板扩散法，从分离自内蒙古牧区手工乳制品的8株乳酸杆菌中筛选出抑菌效果较好的一菌株为Q-1-3，并通过分子学鉴定认定该菌株为L.paracasei。将L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质经排酸、排过氧化氢后对B.subtilisCGM CC（B）63501仍具有明显的抑制作用，但经过不同蛋白酶处理后，抑菌活性在不同程度上有所下降，抑菌物质中含有蛋白类物质。L.paracaseiQ-1-4对指示菌的抑制作用来自其代谢产物，且在培养至6 h时开始具有抑菌活性，22 h左右达到最高。所产生的抑菌物质对B.subtilisCGM CC（B）63501作用方式是抑菌而非杀菌，抑菌谱较广。L.paracaseiQ-1-4所产抑菌物质在pH 2.0～5.0范围内对B.subtilisCGMCC（B）63501有抑制作用。在此pH范围内抑菌物质对热有耐受性，对紫外不敏感，耐储藏，有机溶剂、金属离子、表面活性剂对其影响不显著，但与SDS和EDTA共同作用效果好于单一作用，且对指示菌的作用方式为抑制其生长。

参考文献：

[2]郭兴华，曹郁生，东秀珠，益生乳酸细菌-分子生物学及生物技术，北京：科学出版社，2008.409～411.

[3]代永刚,田志刚,南喜平.乳酸菌及其生理功能研究的进展[J].农产品加工.学刊,2009(7):24-26.DOI：10.3969/j.issn.1671-9646(X).2009.07.007.

[4]ASLIM B,BEYATLIY,YUKSEKDAG Z N.Productions and monomer compositions of exopolysaccharides byLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusandStreptococcus thermophilus strainsisolated from traditional home‐made yoghurts and raw milk[J].International Journal of Food Science&Technology,2006,41(8):973-979.DOI:10.1111/j.1365-2621.2005.01155.x.

[5]LOZO J,VUKASINOVIC M,STRAHIN IC I,et al.Characterization and antim icrobial activity of bacteriocin 217 produced by natural isolateLactobacillus paracaseisubsp.paracaseiBGBUK2-16[J].Journal of Food Protection,2004,67(12):2727-2734.

[6]ATANASSOVA M,CHOISET Y,DALGALARRONDO M,et al.Isolation and partial biochemical characterization of a proteinaceous anti-bacteria and anti-yeast compound produced byLactobacillus paracaseisubsp.paracaseistrain M3[J].International Journal of Food Microbiology,2003,87(1):63-73．

[7]高莹.副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7产肽条件优化及肽类分离研究[D].黑龙江大学,2008.

[8]ASLIM B,BEYATLIY,YUKSEKDAG Z N.Productions and monomer compositions of exopolysaccharides byLac to bacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus andStreptococcus the rmophilusstrains isolated from traditional home‐made yoghurts and rawmilk[J].International Journal of Food Science&Technology,2006,41(8):973-979.DOI:10.1111/j.1365-2621.2005.01155.x．

[9]C ARIDI A.Selection ofEscherichia coli-inhibitingstrains ofLactoba-

[10]沈萍,范秀容,李广武.微生物学试验第三版[M].北京:高等教育社,cillus paracaseisubsp.paracasei[J].Journal of Industrial M icrobiology and Biotechnology,2002,29(6):303-308.DOI:10.1038/sj.jim.7000300.

[11]陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社,1995,(33):382-451.

[12]瑞香.嗜酸乳杆菌及其应用研究[M].科学出版社,2007(26):66-67

[13]赵娜,萨如拉,郭军.瑞士乳杆菌AJT所产抗菌物质的初步研究[J].食品工业科技,2013,34(9):67-71.

[14]吴敬,芒来,贺银凤.马奶酒中抗单增李斯特氏菌细菌素产生菌的筛选及鉴定[J].中国酿造,2011,30(4):119-122.DOI：10.3969/j.issn.0254-5071.2011.04.036.

[15]凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].中国轻工业出社,1999:85,86,100.

[16]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:244-258.

[17]雷虹,李秀凉,庄海霁,等.副干酪乳杆菌HD 1.7产生抗菌物质的初步研究[J].工业微生物,2007,37(4):16-19.DOI：10.3969/j.issn.1001-6678.2007.04.004.

[18]赵娜.抗菌活性瑞士乳杆菌AJT的筛选鉴定及抗菌物质研究[D].内蒙古农业大学,2013.

[19]于娜,陈忠军.具有抑菌作用乳酸菌的筛选及其抑菌物质特性的研究[J].食品科技,2011,36(5):13-17.

[20]YOON M Y,KIN Y J,HWANG H J.Propertiesand safety aspects of Enterococcus faeciuMStrains isolated from Chungkuk jang,a fermented soy product[J].LW T-Food Science and Technology,2008,41(5):925-933.

[21]TURGISM,VU K D,LACRO IX M.Partial Characterization of Bacteriocins Produced by Two New Enterococcus faecium Isolated from Human Intestine[J].Probiotics and Antimicrobial Proteins,2013,5(2):110-120.DOI:10.1007/s12602-013-9129-z.

[22]JABEEN N,GUL H,HUSSIAN SA SM,et al.Biophysicochemical Characterization of Bacteriocins(S)fromindigenously Isolated Agro bacterium Radiobacter NA6[J].Pak JBot,2009,41(6):3227-3237.

[23]李莉.戊糖乳杆菌WH 12-2-1产细菌素的条件优化及其抑菌特性研究[D].内蒙古:内蒙古农业大学,2009.DO I：10.7666/d.y1473817

[24]巨晓英,寇晓虹.副干酪乳杆菌的功能及其在食品工业中的应用研究进展[J].中国乳品工业,2009(8):48-50.DOI：10.3969/j.issn.1001-2230.2009.08.012.

[25]李平兰,张篪,江汉湖.乳酸菌细菌素研究进展[J].微生物学通报,1998,25(5):295-298.

[26]王书晖,彭谦.热杆菌素YN 8674的初步纯化和部分理化性质[J].云南大学学报:自然科学版,DO I：10.3321/j.issn:0258-7971.2000.05.015.

[27]张艾青.产广谱细菌素植物乳杆菌的初步研究及其在泡菜中的应用[D].雅安:四川农业大学,2007.

[28]张帅,王金凤,马永强.嗜酸乳杆菌细菌素的分离纯化及表面活性剂对其活性的影响[J].中国林副特产,2012(5):1-4.

[29]韩雪,周志江.乳酸片球菌细菌素的活性及特性的研究[J].食品研究与开发,2006,27(4):19-21.

[30]滕志利.产广谱细菌素乳酸菌的筛选及其细菌素特性,发酵条件的研究[D].大连工业大学,2013.