婴幼儿配方奶粉中肌醇的测定及稳定性研究

周玮婧，何平，王澍，侯靖

（武汉食品化妆品检验所，武汉430000）

0　引言

肌醇是一种饱和环状多元醇，是作为生物体内的一种必需的营养因子，肌醇具有免疫、预防和治疗某些疾病等多种作用[2]，在很多的保健食品及一些婴幼儿食品中均有添加[2]。气相色谱法是我国检测肌醇的标准检验方法[3-4]。本实验根据国标《GB 5413.25-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定》[5]方法检测，增加山梨醇为内标，方法简单、准确、精密度高。奶粉在存放过程中容易发生结块、潮解、脂肪氧化、等反应，。目前研究多集中于分析婴幼儿奶粉密封储藏过程中物质的变化，而对开封存放中品质变化研究较少[6]。本文采用了优化后的毛细管气相色谱-内标法，跟踪测定180天内开封后奶粉中肌醇的质量分数的变化，为实际食用过程中分析环境对营养物质的作用，提供理论基础。

1　实验

1.1　仪器

Agilent 7890B气相色谱仪：配备毛细管柱分流/不分流进样系统、FID检测器；HP-5毛细管色谱柱（0.32μm，0.25 mm，30 m）；Vortex Gen le2旋涡混和器；Gilson精密移液枪；Beckm an高速离心机；M ettler-Toldeo XP205电子天平；Prim a超声波清洗器；新苗HH-S21恒温热水浴锅；BUCH I旋转蒸发仪和带有螺纹盖的25mL试管等实验室常用仪器设备。

1.2　试剂

正己烷（色谱纯），无水乙醇（分析纯），三甲基氯硅烷（分析纯）、六甲基二硅胺烷（分析纯），N，N-二甲基甲酰胺（分析纯）。硅烷化试剂：分别吸取体积比为1∶2∶8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N,N-二甲基甲酰胺，超声混匀；肌醇标准品（纯度99.2%）。

1.3　色谱条件

载气：氮气（99.999%）；流速：1.0 mL/min；进样口温度：280℃；检测器温度：300℃，不分流；氢气：45 mL/min；空气：450 mL/min；进样体积：1μL。柱温箱程序升温：初始温度120℃，保持0 min，升温速率10℃/min，到190℃，保持18 min，升温速率10℃/min，到240℃，保持30 min。以保留时间定性，内标法定量。

1.4　样品处理

1.4.1试样处理

奶粉样品：称取样品1 g（精确到0.0001 g）于50 mL容量瓶中，加入12 mL约40℃温水溶解试样，加入内标溶液2 mL。超声提取10 min，用体积分数95%乙醇定容至刻度，混匀。静置20min，取10mL于15mL离心管中，5 000 r/min离心5min，取5mL于浓缩瓶中。

1.4.2干燥与衍生

向浓缩瓶中加入10 mL无水乙醇，在80℃下浓缩近干时再加入5 mL无水乙醇继续浓缩至彻底干燥。加入硅烷化试剂10 mL，超声溶解后转移到25 mL有螺纹盖的试管中，在80℃水浴中衍生反应75 min。取出冷却至室温后，加入5 mL正己烷，涡旋混合后静置分层，取上层液3 mL于预先加少许无水硫酸钠的带螺纹盖离心管中，振荡后以转速4 000 r/min离心，吸取上清液过滤膜到进样小瓶。

1.5　标准溶液的配制

1.5.1内标溶液的制备

取山梨醇100m g，置于10 mL容量瓶，用N，N二甲基甲酰胺定容，作为内标溶液（10.0 g/L）。

1.5.2标准溶液的制备

肌醇标准储备液（1.0 g/L）：将肌醇标准品经过105℃烘干2 h，称取100 mg（精确到0.1 mg）于100mL容量瓶中，用25mL水溶解完全，用体积分数为95%乙醇定容到刻度，混匀，4℃保存。肌醇标准工作液（10.0 m g/L）：取1 mL肌醇储备液于100 mL容量瓶中，用体积分数为70%乙醇定容到刻度，混匀。

1.6　标准溶液的配制及质量分数测定

分别取肌醇标准工作液2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL于浓缩瓶中，加入内标溶液200μL，按1.4.2步骤操作，将制备好的样品在与绘制标准曲线相同的色谱条件下进行测定，根据标准曲线计算出样品中肌醇的质量分数。

1.7　结果计算

样品中肌醇质量分数为

式中：X为待测样品中肌醇的质量分数（m g/100 g）；C为样品测定液中肌醇的量（μg）；m为样品称量质量（g），10为稀释倍数。

1.8　稳定性分析

本实验选取5种不同市售品牌婴幼儿配方奶粉，开封后分别于4，20，37℃的温度下，相对湿度为10%的阴凉干燥处存放180 d，并分别在0，30，60，120，180 d测定其肌醇质量分数，其衰减率为

2　结果与讨论

2.1　方法的线性范围与定量

肌醇为环己六醇，山梨醇为己六醇，两者结构相似，且样品中不含山梨醇，因此可以作为内标物使用[7]。奶粉样品的色谱图如图1（a），肌醇标准溶液（40μg）色图谱如图1（b），在本实验的色谱条件下内标和样品的峰保留时间适中，与杂质的分离情况良好，目标物质前后无杂质峰干扰。根据标准曲线步骤测定，以肌醇的量（20，40，60，80，100μg）为横坐标，以标准物（肌醇）与内标物（山梨醇）的峰面积之比Y为纵坐标，绘制肌醇质量分数测定的标准曲线，回归方程为Y=0.4588x+0.0171。本法线性范围较宽，肌醇的量在0～500μg范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.9996。本方法中肌醇的3倍平均信噪比对应的肌醇量为检出限（LOD），10倍平均信噪比对应的肌醇量为定量限（LOQ）。在本研究条件下肌醇的检出限为0.72 m g/100 g，定量限为2.42 m g/100 g，符合奶粉中肌醇的检测要求。

图1　样品与标准品的GC色谱

2.2　方法的精密度与回收率

选择3组肌醇本底量不同的奶粉，称量1 g（精确至0.0001 g）样品各6份，分别按照1.4的方法与国标方法进行分析，并对两种方法的结果进行比较，结果如表1所示。3组奶粉进行6次平行测定，测量精密度RSD在1.02%～3.18%之间，均小于5%，表明两种方法的精密度均能达到测定要求。且内标法与国标（外标法）测定结果无显著性差异，但外标法结果略低于内标法结果。由于婴幼儿配方奶粉中成分复杂，多添加氨基酸、维生素等营养成分，这类杂质经常会和肌醇一起衍生化，影响气相色谱的分离效果，干扰肌醇的测定。采用净化方法操作繁琐，还可能造成样品的损失，所以添加内标物可以极大程度减少基质的干扰，能够显著改善测定的准确度和精密度。

根据上述样品的测定步骤，随机抽取一种婴幼儿配方奶粉作为本底进行加标回收率实验，分别添加低（10 m g/100g）、中（20 m g/100g）、高（50 m g/100g）3个质量分数标准溶液，每个质量分数平行做5次。由表2可以看出，低质量分数组肌醇的加标回收率为98.42%，中质量分数组的加标回收率为99.36%，高质量分数组肌醇的加标回收率为100.97%，同时RSD在0.54%～1.23%之间，均小于5%。实验结果表明，在使用山梨醇为内标时，实验准确可靠，重现性良好，满足微量分析的要求。分别采用国标（外标法）和本方法对样品中肌醇质量分数进行测定，结果显示两种方法无显著性差异，而内标法的回收率（98.42%～100.97%）明显优于外标法（96.61%～97.69%），所以本方法能够用于婴幼儿配方奶粉中肌醇的准确定量检测。肌醇易溶于水，微溶于乙醇，因此我们需先用水提取奶粉中的肌醇。此外，由于肌醇在水中的溶解度会随温度的升高而增大，采用40℃的温水溶解后置于温水浴上保温数分钟，这样充分提取也能提高肌醇测定的准确度[8]。

表1　精密度测定结果比较（n=6）

表2　添加回收实验结果比较（n=5）

2.3　肌醇稳定性试验

表3为5种市售品牌的婴幼儿配方奶粉在不同温度条件下，经过180 d开封存放以后的肌醇衰减率变化情况，可以看出，这5种奶粉肌醇随着存放时间的延长，质量分数逐渐减少，衰减率逐渐增加。以A品牌奶粉为例（图2），肌醇质量分数在每个温度下都有不同程度的衰减，但在低温（4℃）环境下的衰减速率明显较高温（37℃）环境下存放的慢，即在高温环境存放下奶粉中肌醇损失的更快。由表3可以看出，在低温（4℃）存放30 d时，5种奶粉中肌醇衰减率仅为0.40%～0.83%；存放180 d后也仅衰减了3.24%～7.05%；而常温（20℃）存放180 d后，5种奶粉就衰减了12.06%～14.33%；在高温（37℃）存放180 d后，5种奶粉肌醇衰减率高达16.60%～24.07%，速率明显加快，是低温的近4倍。肌醇与牛磺酸、胆碱一样，属于可选择性成分添加，即非强制性营养强化剂。有研究显示[9]，肌醇在密封储藏24个月后衰减了17.67%，这与我们存放期间的研究结果肌醇不断减少的趋势是一致的，相比而言，奶粉开封存放过程中，肌醇质量分数衰减率比密封储藏更快。大多数婴幼儿配方奶粉包装上都有明确规定，奶粉开封后需要在1个月内用完，本文通过肌醇质量分数的持续跟踪测定也充分说明了这一点。由于肌醇极易溶于水，所以为了避免肌醇的氧化，开封后的奶粉应存放于干燥低温环境中，更能减缓奶粉中的营养物质流失。

图2　不同温度下奶粉样品A中肌醇的衰减变化

表3　市售婴幼儿奶粉存放期间肌醇的衰减率 %

3　结论

本文通过优化色谱条件，建立了婴幼儿配方奶粉中肌醇测定的方法。结果显示，方法快速、简便，色谱峰分离度高，添加内标物质定量，受基质影响小；回收率在98.42%～100.97%之间，RSD为0.54%～1.23%，可以满足奶粉样品中肌醇质量分数的准确测定；且检出限为0.1 m g/100 g，具有极高的灵敏性，满足微量测定的要求。分别采用国标法和本方法对样品中肌醇质量分数进行测定，结果显示两种方法无显著性差异。

通过检测5种市售品牌的奶粉在不同温度下开封180 d存放的肌醇质量分数变化，发现肌醇随着时间的延长均有不同程度的衰减，其中在高温（37℃）环境中衰减最快。除温度外，婴幼儿配方奶粉的稳定性还受其他因素的影响，如光照、氧气、水分等。需对各种影响因素的破坏机理进行深入的研究，才能在婴幼儿配方奶粉中科学的使用肌醇等营养元素，以提高奶粉的稳定性。随着人们对食品安全的关注度越来越高，婴幼儿配方奶粉的稳定性及其营养成分的合理化更加受到生产者和消费者的重视。所以，婴幼儿配方奶粉中营养素的强化添加量，除了参照相应国家标准、食品添加剂使用标准、食品营养强化剂使用标准外，还要及时关注卫生部公告中有关食品添加剂和营养强化剂的使用范围和使用量，以便及时更新产品执行标准和标签标示值。质检部门也更应该起到强有力的监督作用，对奶粉中肌醇的检测要做到准确无误。

参考文献：

[1]气相色谱-质谱/质谱法测定牛奶和奶粉中的肌醇[J].中国乳品工业,2011(39):47-64.

[2]孙本风,顾修蕾,孙爱杰等.婴儿配方奶粉货架期内营养强化剂衰减率的研究[J].乳品加工,2012(127):78-82.

[3]金梦,谢守新,林海丹等.婴幼儿配方奶粉中肌醇的液相色谱串联质谱法测定[J].中国乳品工业,2014(42):34-36.

[4]尹建洪.气相色谱法测定奶粉中肌醇含量的研究[J].广东化工,2015(42):215-216.

[5]GB 5413.25-2010食品安全国家标准-婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定[S].北京:标准出版社,2010.

[6]蔡秋杏,戴梓茹,张晨晓.检测牛奶及奶粉中肌醇的气相色谱法研究[J].钦州学院学报,2011(12):44-46.

[7]王波,刘阿静,王彦淳.在线渗析-双柱串联离子色谱法直接检测婴幼儿乳粉中的肌醇[J].分析试验室,2015(34):212-215.

[8]曾静,时逸吟,张孝刚.固相萃取-气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中肌醇含量[J].检验检疫学刊,2014(24):40-42.

[9]胡桂林,张雪峰,崔涛等.两种市售婴幼儿奶粉存放稳定性研究[J].食品科技,2015(40):309-313.

[10]郭会灿,王素娟,郭英.肌醇的研究进展[J].河北化工,2008(7):5-7.