GBE对大鼠肾间质成纤维细胞TGF-β、CTGF及α-SMA过表达的抑制作用

韩 璐，胡 涛，丁雪峰，杨 玉

(吉化集团公司总医院 1.检验科；2.内分泌科，吉林 吉林132000)

肾间质成纤维细胞是肾脏细胞外基质(ECM)的主要生成细胞。高糖等因素在体内体外均可刺激肾间质成纤维细胞增殖，并刺激其合成并分泌胶原(collagen)、纤连蛋白(FN)及弹性蛋白等在内的多种ECM成分，参与肾间质纤维化过程。转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)被认为是强效的致纤维化因子，在肾间质纤维化中起重要作用。有研究表明，糖尿病大鼠肾脏二者表达明显高于正常对照组，表明二者可能在肾间质纤维化发生发展中具有重要作用[1,2]。免疫组化研究显示，注射脲链佐菌素(STZ)4 w后，大鼠肾脏α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达也明显增加，这可能与成纤维细胞的转分化作用有关。有学者认为，肾间质成纤维细胞向肌成纤维细胞(MFB)的转分化数量可作为判断肾间质纤维化程度的主要指标[3]。银杏叶提取物(GBE)是银杏的干燥叶提取物，具有保护心脑血管、改善外周血液循环及降低血清胆固醇等药理作用。李相军等发现，GBE可抑制AngⅡ诱导的大鼠肾成纤维细胞增殖及ECM分泌，并能下调TGF-β及CTGF mRNA表达[4,5]。本研究旨在探讨GBE对大鼠肾间质成纤维细胞TGF-β、CTGF及α-SMA过表达的抑制作用。

1 材料与方法

1.1材料大鼠肾间质成纤维细胞株NRK49f购自上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖及低糖培养基为Invitrogen产品，胎牛血清产自天津灏洋生物技术公司。GBE注射液由三九药业有限公司生产，规格5 ml:17.5 mg，含银杏黄酮苷4.2 mg。兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ECL显色试剂盒为武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司产品。细胞裂解液、Bradford 法蛋白检测试剂盒由碧云天生物技术公司生产。

1.2细胞分组将处于对数生长期的细胞按1×106/孔接种至6孔板，分为对照组、高糖组及12.5 mg/L和25 mg/L GBE处理组。对照组细胞用无血清DMEM培养，高糖组及12.5 mg/L和25 mg/L GBE处理组，则分别用含GBE终浓度为0、12.5和25 mg/L的无血清高糖DMEM培养。每组设3个复孔，实现重复3次。

1.3WesternBlot检测培养结束后，以冷磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤细胞2次，每孔加300 μl细胞裂解液反复吹打以充分裂解细胞，经蛋白定量后按50 μg/孔行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳并经转膜、洗膜、封闭后，用兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗体4℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记抗兔多克隆抗体37℃孵育2 h，充分洗膜后用ECL法显色、曝光后测量X光胶片上条带密度。

2 结果

2.1各组细胞TGF-β和CTGFwesternblot检测结果高糖DMEM作用于NRK49f 24 h后，高糖组细胞TGF-β、CTGF蛋白表达量明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与高糖照组比较，GBE各处理组TGF-β、CTGF表达量明显降低，且GBE高剂量组(25 mg/L)二者表达量明显低于GBE低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

图1 各组细胞TGF-β和CTGF western blot检测结果

分组TGF⁃β/GAPDHCTGF/GAPDH对照组高糖组GBE12．5mg/L 25mg/L1．00±0．151．76±0．25∗1．55±0．12Δ1．28±0．08Δ#1．00±0．122．13±0．14∗1．65±0．16Δ1．12±0．19Δ#

与对照组比较，*P<0.05；与高糖组比较，ΔP<0.05；与GBE低剂量组比较，#P<0.05

2.2各组细胞α-SMA表达检测结果Western blot检测结果显示，正常组NRK49f细胞未检测到α-SMA表达，高糖DMEM作用于NRK49f 48 h时可见明显α-SMA表达，而GBE2个剂量组α-SMA表达量均显著低于高糖组(P<0.05)，见图2、表2。

图2 各组细胞α-SMA western blot检测结果

分组α⁃SMA/GAPDH对照组高糖组GBE12．5mg/L 25mg/L0．00±0．181．00±0．12∗0．46±0．08Δ0．58±0．13Δ

与对照组比较，*P<0.05；与高糖组比较，ΔP<0.05。

3 讨论

研究表明，高糖可刺激肾间质成纤维细胞增殖及ECM表达，糖尿病肾病大鼠肾间质中成纤维细胞明显增生及ECM生成，肾间质TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表达亦明显增加[6-9]。除降糖作用外，GBE还可通过降低Ⅳ型胶原mRNA等途径减少改善2型糖尿病大鼠肾脏ECM的过度积聚，延缓糖尿病肾病及肾间质纤维化发生[10]。

TGF-β分子量25 kD，由两个分子量为12.5 kD的亚基通过二硫键连接而成的同源二聚体，二聚体形式的TGF-β才有生物活性。现已证明，TGF-β是肾间质纤维化过程中最重要的生长因子之一，在肾间质纤维化发生、发展的多个环节起作用。研究表明，TGF-β除直接刺激肾间质成纤维细胞ECM产生外，还可通过促进纤溶酶原激活物抑制物(PAI)和基质金属蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成而减少ECM降解。CTGF是在TGF-β下游起作用的介质。在CTGF启动子上有一个特殊的TGF-β反应元件，TGF-β通过此元件诱导CTGF表达，促进肾间质纤维化的形成。杨敏等[11]研究发现，CTGF可修饰或放大TGF-β1的促成纤维细胞生成作用。本研究中，高糖培养液作用于NRK49f 24 h后，可见TGF-β和CTGF蛋白表达量明显增加，而GBE对此二者有明显降低作用，表明TGF-β、CTGF通路可能参与高糖所致的肾间质纤维化形成，而抑制其生成与活性可能是GBE肾脏保护机制之一。

α-SMA是常用的肌细胞特异性表达蛋白，常用于平滑肌细胞的鉴定。有研究发现，TGF-β、CTGF均可刺激大鼠肾脏成纤维细胞合成向肌成纤维细胞转分化，即由本来不表达α-SMA的肾小管成纤维细胞转分化为有α-SMA表达的肌成纤维细胞。本研究中，高糖刺激NRK49f 48 h后，NRK49f α-SMA表达明显增加，表明肾间质成纤维细胞可能是肾间质纤维化时肌成纤维细胞的来源之一，在培养液中加入GBE后，α-SMA表达量明显低于高糖组，表明抑制肾间质成纤维细胞的转分化可能是GBE抗纤维化的另一机制。

综上所述，除降糖作用外，GBE还可通过抑制F-CTGF途径及成纤维细胞转分化机制抑制ECM合成，保护肾脏结构和功能，提示GBE可能在糖尿病治疗中有重要应用价值。

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