Periostin在大肠癌诊断中的应用

乔 璐，郑 岚，杨照微*，何成彦，方 玲

(1.吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033；2.吉林大学口腔医院 检验科，吉林 长春130021)

尽管近些年在结直肠癌的诊断方法和治疗手段方面获得了一定的进展[1]，仍然无法阻止该病死亡率逐步上升的脚步。统计结果显示：结直肠癌在发达国家中的常见性位列第三，在世界位列第二位[2-4]。许多局限性结直肠癌患者有微转移的疾病通常在初次诊断中不能被发现，导致诊断后数年疾病复发和死亡。因此，我们认为找到一种与肿瘤的侵袭及转移相关的标志物，对于降低本病的新发病例数及死亡率至关重要。本研究将样本分为肿瘤组织及距离肿瘤组织大于5 cm的癌旁正常组织作为对照组，通过二维质谱色谱仪进行筛选：差异蛋白34个，13个上调蛋白。本实验选定上调表达的骨膜蛋白Periostin作为研究对象。

1 材料与方法

1.1研究对象

收集年龄40-70岁之间的结直肠癌患者的肿瘤组织及其配对的癌旁组织(两类标本应为相距10 cm以上的组织标本)，男性17例，女性13例。

1.2主要试剂

考马斯亮蓝、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCL(pH8.8)、1.0M Tris-HCL(pH6.8)、碘代乙酰胺(IAM)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸钠、蛋白质定量试剂盒(RCDC Protein Assay Kit)购于Bio-Rad公司。测序级胰酶、二硫代苏糖醇(DTT)。

1.3方法

(1)蛋白提取及浓度测定：取清洗干净的组织标本50 g，加入预冷的蛋白提取试剂中，在低温环境下静置20 min，高速低温(12 000 rpm，4℃)离心1 h，弃掉沉渣取上清。考马斯亮蓝(Bradford)法测定蛋白浓度，蛋白提取样品保存于-80℃。(2)二维质谱色谱联用技术鉴定蛋白多肽：取酶切的蛋白水解多肽(蛋白∶胰酶=50∶1)溶解于0.1%FA，二维色谱分离条件设定为：流速2 μl/min，洗脱时间3 h。质谱仪检测条件：全扫描后附加10次二级扫描，碰撞能量：35%。(3)免疫印迹鉴定蛋白的表达：SDS-PAGE 电泳，经浓缩胶、分离胶将蛋白按照分子量的不同进行分离，转移分离的蛋白至醋酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗(1∶1000 BSA稀释)低温孵育3 h，PBS洗膜/5 min,共计洗膜5次，每次5 min；二抗(1∶2000 BSA稀释)室温孵育，PBS洗膜/5 min,共计洗膜5次。化学法(ECL 法)发光显色。

1.4统计学处理

2 结果

2.1质谱分析结直肠癌组织与癌旁组织的差异蛋白质

将得到的图谱数据进行分析比对，得到肿瘤组织中的蛋白丰度与癌旁组织的差异性具有统计学意义的蛋白34个，其中Periostin蛋白质谱结果见图1。

图1 Periostin蛋白中AAAITSDILEALGR序列肽段的串联质谱图

2.2免疫印迹验证蛋白Periostin

选取未经治疗的结直肠癌组织与癌旁组织，进行Western blotting检测，结果如图2所示：骨膜蛋白Periostin在肿瘤组织中的表达量高于癌旁正常组织。

A:大肠癌组织；B：大肠癌癌旁组织图2 Periostin在大肠癌及癌旁组织中的表达

3 讨论

结直肠癌在世界范围内的恶性肿瘤中排名第三[1,2]。多学科治疗的进展极大地改善了被诊断为早期疾病的患者的预后，但是被确诊患有晚期疾病的患者的预后依然很差[3]。在对人类多种肿瘤组织的研究中均观察到了细胞粘附蛋白Periostin的踪迹。 最近的几项研究表明，肺癌、肝细胞癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌的血清骨膜素水平被上调[6]。数十位研究人员的研究结果向我们阐述了Periostin对于癌症诊断具有一定的辅助作用。Periostin最初在成骨细胞中被确定为骨和牙齿形成和维持的重要调节者，目前，骨膜蛋白被认为是一种异功能分泌细胞基质外蛋白并与胚胎发育期间的细胞粘附和运动有关[7,8]。越来越多的证据表明，Periostin是一种基质细胞蛋白，参与许多基本的生物过程，如细胞增殖、细胞侵袭和血管生成[9]。Periostin是胶质瘤恶性肿瘤和潜在的肿瘤复发的强大标志物。抑制Periostin后，胶质瘤干细胞致瘤性的消除为探索靶向Periostin的治疗效果提供了支持[10]。本研究，通过二维质谱色谱联用技术与免疫印迹方法筛选并验证了骨膜蛋白Periostin在结直肠癌中的上调表达。目前，研究虽然提示我们Periostin蛋白参与了细胞粘附和运动，同时与肿瘤的转移及血运相关，此外在血清中也能够检测到Periostin的表达，我们推测正是由于Periostin的过量表达，一方面，促进了细胞之间的粘附，从而促进细胞的增殖；另一方面，高表达的Periostin增强了细胞的运动，进而促成了肿瘤的转移。

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