胰腺导管腺癌中miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表达水平及临床意义

赵立新,辛瑞强,李胜利,胡志伟,刘连杰,阿斯根,萨其日拉图

(内蒙古自治区人民医院 肝胆外科,内蒙古 呼和浩特010017)

过去几十年,胰腺癌的发病率逐年上升,胰腺癌具有高度侵袭性,预后较差,发病率与死亡率基本相当,在世界范围内也是最具挑战的恶性肿瘤[1,2]。性别、年龄、吸烟、肥胖、糖尿病可能与胰腺癌发病有关,但确切病因仍不清楚。近来MiR-21在基因调节及肿瘤的发生发展中受到广泛的关注,在直肠癌、胃癌、乳腺癌及肺癌报道较多[3-6]。本研究拟选取胰腺导管腺癌细胞为研究对象,探讨miR-21、Bcl-2、C-myc及PTEN在胰腺导管腺癌癌细胞内表达情况,阐明miR-21在胰腺导管腺癌中的可能发病机制。

1 资料与方法

1.1临床资料收集我院2012年12月-2015年12月胰腺导管腺癌的组织学标本共38例,以及正常胰腺组织12例,组织标本离体后立即放在液氮中保存。所选手术病例术前均未接受过放疗、化疗及生物治疗,所有病例均签署知情同意书。38例标本男性25例,女性13例；年龄在42-79岁,中位年龄62.5岁；肿瘤位于胰头部的25例,腺尾部13例。胰腺癌病理分期参照2010年的胰腺癌UICC/AJCCNM分期标准。

1.2主要实验试剂Bcl-2抗体、c-Myc抗体、PTEN抗体(p-actin Abeam公司),Taq MicroRNA Reverse Transcription (ABI公司),Trizol Reagent(Invitrogen公司),EDTA(美国Promega公司),羊抗鼠二抗(美国Jackson公司),ABC试剂盒和DAB试剂盒(美国Vector公司),DYY6B电泳仪(美国Bio-Rad公司),超低温冰箱(日本三洋公司),荧光定量PCR仪及分析软件(美国ABI),FluorChem 9000凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司),ambda 35紫外/可见光分光光度计(Perkin Elamr公司)。

1.3Real-timePCR检测mRNA表达水平收集患者胰腺导管腺癌组织标本及癌旁配对的正常胰腺组织样本,提取mRNA,分光光度计分析总RNA纯度和浓度,通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性。按照Takara公司逆转录试剂盒提供的操作程序进行逆转录反应生成cDNA。按照Takara公司逆转录试剂盒提供的miR-21通用引物及内参U6和PTEN、Bcl-2和c-Myc的引物及内参β-actin,使用ABI7300Real-timePCR系统对上述检测指标(miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc)进行相对定量分析。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。设定程序为： 1)52℃反应1 min；2) 92℃反应5 min；3) 92℃反应10 sec；4) 56℃反应50 sec；5)重复步骤第3)到第5)一共40个循环。结果计算：2-ΔCt表示real-time PCR相关目的基因在组织的表达水平。

1.4Western-blot法检测蛋白表达提取收集的胰腺癌组织及正常胰腺组织总蛋白,按试剂盒操作要求,经PAGE电泳分离、转膜、封闭及PTEN、Bcl-2以及c-Myc 抗体杂交,然后用化学发光显色鉴定,再用凝胶成像系统成像。计算目的蛋白相对表达量(目的条带的灰度值/同一样本内参的灰度值)。

1.5统计学处理采用配对T检验检测胰腺癌组织与癌旁组织的目的基因平均表达水平,χ2检验检测各基因相对表达水平与胰腺临床病理特征之间的相互关系,P<0.05表示差 异具有统计学意义,统计采用SPSS15.0软件包。

2 结果

2.1miR-21在胰腺导管腺癌组织中的表达分别提取胰腺导管腺癌组织、正常组织总RNA,利用QRT-PCR法检测miR-21的表达情况,在胰腺导管腺癌组织样本中miR-21的平均相对表达量为3.37±0.25,正常胰腺组织中其平均相对表达量为0.74±0.07,胰腺导管腺癌组织样本中miR-21的平均表达水平要明显高于正常胰腺组织样本的平均表达水平(P<0.05),具有统计学意义。

2.2PTEN蛋白在胰腺导管腺癌组织中的表达与正常组织中表达量比较,Western blot分析显示PTEN蛋白在胰腺导管腺癌组织表达显著下降,差异显示具有统计学意义(0.87±0.032,0.54±0.024，P<0.05)。 见图1。

2.3Bcl-2蛋白在胰腺导管腺癌组织中的表达与正常对照组相比,Bcl-2蛋白在胰腺导管腺癌组织的表达显著增加,差异具有统计学意义(0.12±0.014,0.39±0.031,P< 0.05)。见图2。

2.4c-Myc蛋白在胰腺导管腺癌组织中的表达与正常胰腺组相比,c-Myc蛋白在胰腺导管腺癌组织的表达显著增加,差异显示具有统计学意义(0.054±0.003,0.21±0.020,P<0.05)。见图3。

图1胰腺导管腺癌组织中PTEN蛋白的表达差异图2胰腺导管腺癌组织中Bcl-2蛋白的表达差异图3胰腺导管腺癌组织中c-Myc蛋白的表达差异

2.5miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表达水平与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系见表1。

表1 miR-21、Bcl-2、c-Myc及PTEN表达水平与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

MicroRNAs是一类大约20个核苷酸组成的非编码RNA[7,8],参与细胞的分化、增殖、细胞周期和代谢等各种生物过程。更重要的是它能通过激活原癌基因和抑制抑癌基因参与肿瘤的发生发展[9,10]。miR-21是最常见的与癌症相关的MicroRNA,先前的研究显示miR-21在许多癌症中表达失调,在肿瘤的发生发展中起着关键作用[11-13]。miR-21的潜在机制通过作用于PTEN增强肿瘤的侵袭力。本研究通过Real-time PCR法检测胰腺导管腺癌及对应癌旁组织中miR-21的表达,发现miR-21在胰腺导管腺癌组织中的表达要显著高于对应的正常胰腺组织,表明miR-21与胰腺导管腺癌密切相关,参与了胰腺导管腺癌的发生发展。

PTEN是一种抑癌基因。在细胞迁移、扩散和侵袭中起着重要作用。能通过负向调节AKT信号通路[14,15],使AKT信号通路失活,进一步干扰下游众多的信号通路,从而调控肿瘤的增殖、迁移和侵袭[16,17]。Meng等[18]发现抑制肝癌细胞中miR-21的表达能提高PTEN的表达。Giovannetti 等[19]报道转染pre-miR-21能引起PTEN表达的下降。提示PTEN是miR-21的直接靶基因。本研究通过Western-blot方法检测胰腺导管腺癌组织及胰腺癌旁组织中PTEN蛋白的表达,发现PTEN在胰腺导管腺癌组织中的表达下调,表明PTEN参与了胰腺导管腺癌的发生发展。

Bcl-2基因为抑癌基因,能够抑制肿瘤细胞的凋亡,从而促进肿瘤的发生发展。c-Myc基因是一种重要的原癌基因,它促进细胞分裂,本研究结果显示Bcl-2、c-Myc在胰腺导管腺癌组织中的表达要明显高于正常胰腺组织,提示Bcl-2、c-Myc与胰腺导管腺癌密切相关,可能通过抑制胰腺导管细胞凋亡、促进其增殖、分化参与胰腺癌的发病过程。

本研究发现胰腺导管腺癌组织中miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc的表达与T分期、淋巴结有无转移和TNM分期有密切关系。尽管上述四个指标中miR-21、Bcl-2和c-Myc的表达明显升高,PTEN表达明显降低。但是在T分期Ⅲ+Ⅳ、存在有淋巴结转移和TNM分期Ⅲ+Ⅳ胰腺导管腺癌患者的癌组织中,miR-21、Bcl-2和c-Myc的表达升高、PTEN表达降低更加明显。miR-21和PTEN的表达在肿瘤的大小方面也有这种趋势。而miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc的表达在患者的年龄、性别以及肿瘤的部位方面则无这种差别。提示miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc可能或共同参与胰腺导管腺癌的分化及转移,与肿瘤的进展程度有关,可以用于胰腺导管腺癌的诊断及预后。

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