胸水γ干扰素特异性效应T细胞检测对结核性胸膜炎诊断的价值评估

王 俊,戴亚新,刘 君,王盼盼,尚忠波,周希科,翟桦梓,欧勤芳,裴 豪

(无锡市第五人民医院 结核病诊断实验室，江苏 无锡214005)

结核性胸膜炎(TBP)是由结核菌或其代谢产物进入胸膜腔，引起胸膜腔胸膜对结核毒素出现免疫反应引起渗出的结果，作为一种常见、多发的疾病，约占渗出性胸腔积液病因的54.8%[1]。目前结核性胸膜炎诊断的主要手段是影像学、胸腔积液细菌学检查(抗酸染色涂片和结核分枝杆菌培养)、胸膜活检等。细菌学检查阳性检出率低于5%～25%[2]，且检测周期长，给临床早期诊断带来了困难。胸膜活检被视为诊断结核性胸膜炎的金标准[3]，但由于此项技术的缺点是对患者有一定的创伤，因此不作为诊断结核性胸膜炎的常规手段。γ干扰素特异性效应T细胞检测技术是近年来发展起来的一项新的诊断结核病的免疫学检测技术，该方法通过检测结核分枝杆菌(Mtb)特异性抗原刺激外周血单核细胞(PBMCs)γ干扰素(INF-γ)的分泌情况诊断结核杆菌的感染。本文通过比较外周血、胸水中结核分枝杆菌特异性抗原(CFP-10、ESAT-6)刺激特异性效应T细胞分泌INF-γ的斑点试验(ELISPOT)，探讨胸水检测对结核性胸膜炎的诊断和鉴别诊断价值。

1 材料和方法

1.1研究对象

病例均来源于无锡市第五人民医院结核科。实验组：结核性胸膜炎组患者35例，男性31例，女性4例，年龄20-87岁，平均(62.5±21.4)岁，均为初治患者；对照组：肿瘤性或其他非结核炎性感染性胸膜炎患者40例，男性32例，女性8例，年龄24-83岁，平均(61.8±20.3)岁。上述患者均排除艾滋病感染。

入选标准：实验组：①胸腔积液结核分枝杆菌抗酸染色涂片和(或)培养阳性，细菌培养阴性；②胸膜活检符合结核表现；③临床具备TBP的表现，如低热、盗汗、乏力、胸闷、渗出性胸腔积液等，且抗结核治疗有效。符合以上三条标准之一即可入组。对照组：①胸水为渗出液，结核分枝杆菌培养和(或)抗酸染色涂片阴性；②胸膜活检排除结核且抗结核治疗无效。符合以上两项之一者可入组。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集治疗前患者静脉血5 ml，同时留取患者新鲜胸腔积液50 ml，2 h内送检，4 h内完成细胞分离。

1.2.2INF-γ的效应T细胞斑点试验 根据试剂盒说明书(Oxford Immunote Ltd.，Oxford，UK)进行。分离外周血或胸水PBMCs，并将PBMCs浓度稀释成2.5×106/ml的细胞终溶液。在有γ-干扰素抗体的微孔板上的4个孔中，依次加入细胞培养液50 μl作为阴性对照孔、结核分枝杆菌特异混合多肽ESAT-6抗原50 μl作为测试孔A、结核分枝杆菌特异混合CFP-10抗原50 μl作为测试孔B、植物血凝素50 μl作为阳性对照孔，然后在每孔中各加入100 ml细胞终溶液。在37℃，保持湿润的含有5%的CO2培养箱中孵育16-20小时。后用PBS洗板4次，每个反应孔加入50 μl标记抗体工作液，4-8℃孵育1小时后洗板。加底物于常温避光条件下显色7分钟后在显微镜下进行斑点计数。当满足以下条件时判定为阳性结果：阴性对照孔斑点数为0-5个，测试孔A或B斑点数减去阴性对照孔斑点数≥ 6个；阴性对照孔斑点数6-10个，测试孔A或B斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。如果不符合上述标准且阳性对照孔反应正常则检测结果为阴性。

1.2.3胸水腺苷脱氨酶(ADA)检测 采用酶动力学法。以奥林派斯5400全自动生化分析仪作为检验仪器，选用北京九强生物技术有限公司试剂盒，以腺苷脱氨酶>25 U/L作为阳性判定值。

2 结果

2.1结核组CFP-10与EST-6分别刺激外周血效应T细胞释放INF-γ的斑点数为28.6±21.2，65.9±34.6，刺激胸水效应T细胞释放INF-γ的斑点数为150.0±104.5,152.9±105.4(表1)。CFP-10与EST-6刺激胸水效应T细胞斑点数明显高于刺激外周血效应T细胞释放的斑点数，且具有统计学意义(P<0.001)(图1)。

2.2通过 ROC 曲线分析得出，CFP-10与EST-6分别刺激外周血效应T细胞释放INF-γ的斑点试验曲线下面积分别为AUC=0.745，AUC=0.815。CFP-10与EST-6分别刺激胸水效应T细胞释放INF-γ的斑点试验曲线下面积分别为AUC=0.944，AUC=0.938。分析胸水ADA曲线下面积得出AUC=0.6(表1)。胸水效应T细胞释放INF-γ的斑点试验对于结核的诊断效果明显高于外周血及胸水ADA检测，特异性，敏感性都能达到90%以上。

表1 结核组CFP-10与EST-6分别刺激外周血/胸水效应T细胞释放INF-γ的斑点数

注：*胸水、全血对应刺激物ESAT-6、CFP-10的T-spot．TB计数曲线下面积(ROC)的比较，P<0.001。

图1 结核组：CFP-10与EST-6分别刺激外周血/胸水效应T细胞释放INF-γ的斑点数

3 讨论

IFN-γ释放实验(IGRAs)被认为是近年来结核病诊断方面的一个重大突破。IGRAs的诊断原理为：受到结核分枝杆菌抗原刺激而致敏的T细胞，再次遇到同类抗原时能产生IFN-γ，因此对全血或分离的外周血PBMC在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后产生的IFN-γ进行检测，从而判断机体是否存在结核分枝杆菌病感染。该项技术具有较高的敏感性和特异性，且不受机体免疫力及卡介苗接种的影响，目前已被美国疾病控制预防中心(CDC)的最新指南中被推荐作为一种替代结核菌素皮试(TST)的检测方法[4]。

结核分枝杆菌感染后细胞免疫应答起主要免疫应答作用，CD4+T淋巴细胞为优势的免疫细胞亚群有向病灶迁徙的作用，并在感染部位产生保护性免疫应答，在病变局部发挥抗结核的免疫作用[5]。本文研究发现采用CFP-10与EST-6刺激胸水效应T细胞斑点数明显高于刺激外周血效应T细胞释放的斑点数，且具有统计学意义。通过ROC曲线分析

发现，胸水效应T细胞释放INF-γ的斑点试验对于结核的诊断效果明显高于外周血及胸水ADA检测，特异性、敏感性都能达到90%以上。表明应用γ干扰素特异性效应T细胞检测对结核性和非结核性胸膜炎有鉴别诊断作用。

ADA是一种在淋巴细胞和淋巴组织中表达，并与机体细胞免疫活性密切相关的核酸代谢酶，在一些恶性疾病(如淋巴瘤)、感染性疾病、结缔组织疾病侵犯胸膜时，胸腔积液中ADA水平也会升高[6]。本文结果显示，胸水ADA ROC曲线下面积0.6，其特异性，敏感性远不如胸水/外周血T-SPOT.TB实验。

综上所述，胸水γ干扰素特异性效应T细胞检测对于结核性胸膜炎的诊断有着较高的敏感性和特异性，对于结核性胸膜炎患者和非结核性胸膜炎的早期诊断及鉴别诊断具有较高的临床应用价值。

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