食品中单增李斯特菌检出的能力验证
2018-03-26李苗苗乌海市检验检测中心
□ 李苗苗 乌海市检验检测中心
能力验证是利用实验室间比对来判定实验室或检查机构能力的活动，是检验实验室检测水平的一项重要渠道。实验室能够利用能力验证这种外部质量控制手段，识别与其他实验室之间的差别，监督和改进检测人员的检测能力，对所用方法和仪器进行确认，并结合实验室的内部质控，为自身的不断改进和完善质量管理体系提供重要信息。2018年7月份本中心微生物实验室参加了由中国食品药品检定研究院负责实施的“NIFD-PT-147食品中单核细胞增生李斯特氏菌检出能力验证”。2018年12月实施单位公布乌海市检验检测中心检测结果为“首次满意”（首次即非补测），本文通过探讨食品中单增李斯特氏菌检出能力验证过程，为今后实验室致病性微生物的检出能力提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 样品来源
样品由中国食品药品检定研究院提供，样品为两个冻干细菌混合样，编号：CODE106、CODE261。
1.2 标准菌株
阴性对照菌英诺克李斯特氏菌，菌株编号ATCC33090；阳性对照菌1单增李斯特氏菌，菌株编号CICC 21635；阳性对照菌2伊氏李斯特氏菌，菌株编号ATCC 19119。
1.3 试剂与仪器
李斯特氏菌增菌肉汤（LB1、LB2）基础（批号：180412）、吖啶黄素3.0 mg（批号：180418）、吖啶黄素5.0 mg（批号：180423）、萘啶酮酸5.0mg（批号：180419）、萘啶酮酸4.0mg（批号：180413）、PALCAM琼 脂 平 板（ 批 号：180426）、TAS-YE平 板（ 批 号：171201）、血琼脂平板（批号：180621）、SIM 培 养 基（ 批 号：180621），以上培养基均购自北京路桥技术股份有限公司；李斯特氏菌显色平板（批号：P 001190），购自法国科马嘉。所使用培养基均在有效期内。
革兰氏阳性细菌鉴定卡（以下简称GP卡），购自法国梅里埃公司（编号：2420501103）；VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定仪、电子比浊仪，购自法国生物梅里埃公司。
1.4 方法
按NIFD-PT-147 食品中单增李斯特菌检出能力验证作业指导书和食品安全国家标准《食品微生物学检验 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30-2016）进行检测。
1.4.1 增菌
无菌操作将两个西林瓶内小球分别加入到10mL LB1中，充分溶解并混匀，同时做空白对照，30℃培养24h，分别移取0.1mL，转种于10mL LB2增菌液内。
1.4.2 分离
取两个样品及空白对照样的LB2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板，36℃培养24h，同时做阳性和阴性对照。
1.4.3 纯化
自选择性琼脂平板上分别挑取典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上划线，36℃培养24h。
1.4.4 鉴定
(1)动力试验：从TSA-YE平板上挑取纯培养菌落，穿刺SIM动力培养基，28 ℃培养72 h，详见附表。
（2）生化鉴定：从TSA-YE平板上挑取纯培养菌落，使用全自动微生物鉴定系统进行鉴定。
（3）溶血试验：从TSA-YE平板上挑取纯培养菌刺种到血平板上，并刺种阳性对照菌（伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），36 ℃培养 48h。
1.4.5 结果
食品中单增李斯特氏菌检出能力验证结果见表1。
两个样品在科马嘉显色培养基上长出两种蓝色菌落，其中一种带有白色晕环，而另一种不带有白色晕环，经VITEK 2 COMPACT鉴定，带有白色晕环的蓝色菌落为单增李斯特氏菌（99% Listeria monocytogenes）,而不带有白色晕环的蓝色菌落为英诺克李斯特氏菌（99%Listeria innocua），所以两个样品均为检出单增李斯特氏菌。
2 讨论
（1）李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到[2]实验过程中，样品增菌、分离应做空白对照实验。溶血试验应带有阴性对照和阳性对照，否则检验者可能对GB 4789.30-2016中“狭窄、清晰明亮溶血圈”和“宽的、轮廓清晰的溶血区域”没有相应的衡量标准。
表1 食品中单增李斯特氏菌检出能力验证结果
（2）单增李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的菌落形态在PALCAM培养基上无明显差异，均为圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，原因是PALCAM培养基中含有七叶甙的成分，上述两种李斯特氏菌均能水解七叶甙，并且与铁离子产生焰色反应而使菌落为灰绿色，并带有棕褐色水解圈，从而导致两种李斯特氏菌无法被有效区分[3]。而科马嘉显色平板可以有效鉴别单增李斯特菌和英诺克李斯特氏菌，前者在科马嘉显色平板上为蓝色菌落，带有白色晕环，而后者为不带白色晕环的蓝色菌落。
（3）VITEK 2 COMPACT方法 是GB 4789.30-2016允许的鉴定方法，较传统生化鉴定不仅方法更加准确、快速，还减少了人为因素的干扰[4]。鉴定用菌落宜经过纯化培养，避免从显色平板上直接挑取进行鉴定。因为选择平板中所含有的特殊化学成分对细菌有毒性，导致药敏分析反应不灵敏，可能使结果判读有误[5]。
