DPPH法测定莲蓬原花青素清除自由基能力研究

□ 吴佳红 王建美 金华职业技术学院 姚周平 金华眼科医院 葛彬洁 林小柯 金华职业技术学院

自由基引发的过氧化作用不仅是食品营养和味道变劣的一个重要原因，而且与关节炎、心脑血管疾病、衰老、肿瘤及炎症等许多病理、生理现象相关。大量证据表明，病理生理状态下氧自由基的慢性或急性过度产生可诱发或加重心脑血管疾病；抗氧化物质通过减少自由基的产生实现有效克服过量自由基所带来的危害。原花青素是目前国际上公认最有效的清除人体内自由基的天然抗氧化剂，其清除自由基能力和抗氧化作用是维生素E和维生素C的数十倍，能预防和治疗80多种因自由基引起的疾病，同时也能改善人体微循环[1-2]。

莲蓬是睡莲科莲属多年生水生草本植物莲（Nelumbo nuciferaGraertn.）的成熟花托。国内外研究表明，莲蓬中含有较为丰富的原花青素。本研究以莲蓬中提取分离的原花青素为研究对象，通过DPPH法测定其抗氧化清除自由基能力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所需仪器有721型紫外可见分光光度计、HH-2数显恒温水浴锅、EYELA SB-1100旋转蒸发仪、SB30001电子天平、JHBE-50T闪式提取器及101型电热恒温干燥箱。试验所需试剂有原花青素标准品、DPPH·标准品、XB大孔吸附树脂、维生素C，还有香草醛、浓盐酸等试剂（均为分析纯）。莲蓬采摘于浙江省金华市武义，经金华职业技术学院鉴定为睡莲科莲属植物莲。

1.2 试验方法

1.2.1 DPPH·标准曲线的制作

精密称定DPPH·标准品7.5mg，甲醇定容至100mL，配成质量浓度为75μg/mL的标准溶液，置于冰箱中保存备用（现配现用）。分别取0、1、2、4、8 mL和10mL标准溶液，甲醇定容至10mL，515nm波长处测其吸光度。

1.2.2 莲蓬提取物制备

采用闪式法[3-4]制备莲蓬提取物。将新鲜莲蓬用恒温干燥箱烘干，接着粉碎过40目筛，准确称取该干莲蓬粉入提取罐，按料液比1∶24加60%乙醇提取液，称重，闪式提取2min，放冷，再称重，用提取液补足减少的质量，摇匀，过滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩，得莲蓬提取物干粉。

1.2.3 莲蓬提取物中原花青素含量的测定

称取一定量莲蓬提取物干粉，加甲醇溶液配置成莲蓬提取物甲醇溶液，取1mL该溶液于10 mL试管中，依次加入3%香草醛-甲醇溶液3mL和浓盐酸溶液1.5mL，摇匀，在25℃下显色30min。以甲醇溶液为空白对照，λ=500nm处紫外可见分光光度计测吸光度。根据原花青素标准曲线的回归方程计算莲蓬提取物中原花青素得含量为85.6%。

1.2.4 自由基清除率测定试验

精密称定莲蓬原花青素粉末，甲醇为溶剂，配制成不同浓度的莲蓬原花青素液作为试验组，分别取0.2mL样液，加入2.6mL75μg/mL的DPPH·标准液，以甲醇作为空白对照。同时，配制等浓度的维生素C作为对照。将混合液摇匀，在515nm处测定其在不同时间的吸光度值，根据1.2.1项下的标准曲线换算成[DPPH·]的质量浓度，从而计算出[DPPH·]的残留率。根据该残留率和相应的莲蓬原花青素添加量，可以绘制莲蓬原花青素清除[DPPH·]自由基的曲线，通过线性回归分析可得到两者的回归方程。添加自由基清除剂后的DPPH·残留率计算公式如下：

式（1）中，[DPPH·]REM为添加自由基清除剂后的DPPH·残留率，[DPPH]T=0为DPPH·的原始质量浓度，[DPPH·]T为自由基清除过程中某时的DPPH·质量浓度。

1.2.5 半抑制量（EC50）的计算和清除自由基能力（AE）的评价

根据莲蓬原花青素清除DPPH·自由基的曲线所得的回归方程，计算得到[DPPH·]的原始质量浓度减少至50%时莲蓬原花青素的添加量。自由基清除能力AE=1/EC50。根据AE值判断抗氧化剂清除自由基的能力大小，其值越大表明抗氧化剂清除自由基能力越强。

2 结果与分析

2.1 DPPH·标准曲线

根据1.2.1项下得到的数据，以溶液浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘得标准曲线（见图1）。其线性回归方程为A=0.0195C+0.0092，R2=0.9995。

2.2 莲蓬提取物自由基清除率

DPPH·溶液中加入各浓度莲蓬提取物溶液约15min后，DPPH·溶液的吸光度不再改变，反应完全，记录该时的测定值Ai和Aj，见表1。

2.3 维生素C自由基清除率

DPPH·溶液中加入各浓度维生素C溶液（对照品）约15min后，DPPH·溶液的吸光度不再改变，反应完全，记录该时的测定值Ai和Aj，见表2。

图1 DPPH·标准曲线

表1 莲蓬提取物对DPPH自由基的清除率

表2 维生素C对DPPH自由基的清除率

2.4 莲蓬提取物组和维生素C组抗氧化活性对比

根据莲蓬提取物添加量与DPPH·清除率的关系，绘制关系曲线并回归分析得回归方程，再利用SigmaPlot软件计算得出莲蓬提取物清除DPPH·的EC50为107.2g/kg，AE为0.0093，维生素C清除DPPH·的EC50为130.3g/kg，AE为0.0077。

3 讨论

DPPH法是判定药物体外抗氧化活性的经典方法。本研究结果表明随着莲蓬提取物剂量的增加，DPPH·清除率相应增加，且成剂量依赖关系，这说明莲蓬原花青素与DPPH·在反应初期结合生成DPPH-PheO，消耗DPPH·，降低DPPH·的含量。而当莲蓬提取物用量在0.125mg/mL以上时，DPPH·的含量不再相应降低。这可能是DPPH·减少到一定程度时会出现原花青素中的羟基和DPPH·相互竞争生成PheO-PheO，从而抑制原花青素与DPPH自由基的结合所致[5]。

本试验结果显示，DPPH法可以用于莲蓬原花青素抗氧化能力的测定。莲蓬提取物抗氧化清除自由基能力大于维生素C。莲蓬提取物和维生素C的清除DPPH·的半抑制量EC50分别为107.2、，130.3g/kg，其清除自由基的能力AE分别为0.0093、0.0077。