季节性流感疫苗研究进展

于志君，崔力文，程凯慧，高玉伟

流感是由流感病毒引起的一种可在人和多种动物间传播的呼吸道传染病[1]。根据流行程度和规模的不同，流感流行可分为流感大流行和季节性流感流行。根据抗原性和基因序列的不同，流感病毒可以分为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒4种类型[2-3]。其中A型流感病毒可引发流感大流行，A型流感病毒和B型流感病毒均可引发季节性流感流行。A型流感病毒根据表面蛋白血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）抗原性的不同可分为18种HA亚型和11种NA亚型[4-5]，目前引起季节性流感疫情的主要有2种亚型，H1N1亚型和H3N2亚型[6]。B型流感病毒分为2种类型，B/Yamagata/16/88样B型流感病毒（Yamagata系）和B/Victoria/2/87样B型流感病毒（Victoria系）[7]，均可引发季节性流感疫情。综上所述，目前可引发季节性流感疫情的流感病毒主要有4种，分别是H1N1亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒以及2种B型流感病毒。

温带气候条件下，季节性流感主要发生在冬季，而在热带地区，全年都可能发生流感，疫情暴发不规律[8]。季节性流感的特征包括高热、咳嗽、头痛、咽痛、流鼻涕、肌肉和关节痛以及严重的身体不适[9]。多数人在1周内康复，临床症状消失。季节性流感从感染到发病的时期称为潜伏期，约为2 d。季节性流感的流行可严重影响任何年龄段的人群，但出现并发症风险最高的是孕妇、6～59个月儿童、老人、患有慢性疾病（艾滋病、哮喘、慢性心肺疾病等）的人群以及卫生保健人员[10]。根据WHO的报道，季节性流感每年都会在世界范围内肆虐，对老人、儿童以及免疫功能低下人群的危害尤其严重，每年会夺走大约50万人的生命，对公共卫生安全构成巨大威胁[11]。疫苗是目前应对季节性流感疫情最有效的手段，因此，WHO为了应对季节性流感疫情，每年都会在2—3月、9月召开会议，推荐南、北半球季节性流感疫苗病毒株，其中2—3月是针对本年度的北半球流感季（北半球通常在每年10月至次年5月间发生季节性流感流行，2月为高峰），而9月则是针对下一年度的南半球流感季。此外，全球最新的季节性流感监测信息都可从WHO网站（http://www.who.int/inf l uenza/surveillance_monitoring/updates/en/）上获取。

目前常用的季节性流感疫苗分为两大类，一类是灭活疫苗，另一类是减毒活疫苗，其中灭活疫苗主要为裂解疫苗。此外，目前在研的季节性流感疫苗还包括病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗、细胞培养流感疫苗等。本文将结合最新的研究进展，综述目前季节性流感疫苗的研究和应用情况。

1 常用季节性流感疫苗

1.1 裂解疫苗 流感病毒裂解疫苗是通过采用WHO推荐的流行毒株，经过鸡胚孵化培养收获病毒，再结合灭活疫苗生产工艺制备而成[12]。主要生产过程包括收获流感病毒，通过裂解剂在适当的裂解条件下裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留有效抗原成分 HA蛋白和NA蛋白，去除裂解剂以及纯化有效抗原成分等步骤，制备的流感病毒裂解疫苗可有效保持流感病毒的免疫原性，还能够降低疫苗接种后不良反应发生的几率，具有良好的安全性[13]。

我国目前使用的季节性流感疫苗主要是流感病毒裂解疫苗[14]。2018年以前，我国生产的流感病毒裂解疫苗全部为三价流感疫苗，然而三价疫苗在预防季节性流感疫情方面有时候会出现覆盖不全面的问题。例如，2017—2018年季节性流感季，我国季节性流感疫苗株组分包括A1型病毒（WHO当年推荐的H1N1亚型流感病毒流行株）、A3型病毒（WHO当年推荐的H3N2亚型流感病毒流行株）和BV型病毒（WHO当年推荐的Victoria系B型流感病毒流行株）。而2017年12月—2018年初，我国各地流感疫情明显增多，且该高发季，以Yamagata系B型流感病毒毒株占流行优势，H1N1亚型流感病毒和H3N2亚型流感病毒共同流行[15]。由于本季三价流感疫苗含有的B型流感毒株成分并非是我国占流行优势的Yamagata系毒株，进而导致流感疫苗的保护效果受到一定的影响，引发流感疫情[16-17]。为了覆盖近年来全球流感病毒流行的主要亚型，研发使用四价流感疫苗就成为当前疾病防控的一种迫切需求。2018年6月8日，我国国家食品药品监督管理局批准了华兰生物疫苗有限公司等企业的四价流感病毒裂解疫苗的生产注册申请，获批上市的四价流感病毒裂解疫苗除包含普通三价流感疫苗的A1、A3、BV型病毒外，还包含BY型病毒（WHO当年推荐的Yamagata系B型流感病毒流行株），这也是2017—2018年我国流感季流行的主要病毒株，该四价疫苗主要用于预防3岁及以上人群流感病毒的感染。四价流感病毒裂解疫苗是对我国流感病毒疫苗品种的有力补充，将与三价流感疫苗一起共同对我国防控季节性流感疫情发挥重要作用。

流感病毒裂解疫苗的临床不良反应主要包括头疼、出汗、肌肉疼、关节疼、高热、感觉不适、寒战、疲倦、瘙痒、荨麻疹或非特异性皮疹等，此外注射部位有可能会出现发红、肿胀、疼痛、皮肤出血以及硬结等局部反应。以上临床不良反应不需任何治疗，症状通常在1～2 d内自然消退。

1.2 亚单位疫苗 20世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了亚单位表面抗原HA和NA疫苗，通过选择合适的裂解剂和裂解条件，将流感病毒膜蛋白HA和NA裂解下来，选用适当的纯化方法得到纯化的HA和NA蛋白。亚单位型流感疫苗具有很纯的抗原组分，可用于儿童。1980年英国首次批准使用该种疫苗，而后扩展到其他国家。多年的临床应用表明亚单位疫苗与流感裂解疫苗同样具有很好的免疫效果和临床安全性，接种人体后可刺激机体产生相应的抗体[18]。流感病毒亚单位疫苗的临床不良反应与流感病毒裂解疫苗的基本相同，但发生几率更低。

1.3 减毒活疫苗 相较于流感灭活疫苗，流感减毒活疫苗有众多优点，包括避免肌肉注射造成的疼痛、接种人群范围更广、能激发较好的黏膜免疫及细胞免疫和免疫持续时间较长等[19]。

目前上市的流感减毒活疫苗主要是以鸡胚生产的冷适应性减毒活疫苗。冷适应性减毒活疫苗具备冷适应性、温度敏感性和减毒性这3个特性。冷适应特性是指病毒能够在25 ℃和33 ℃进行高效的复制；温度敏感性是指A型流感病毒在39 ℃时不能复制，B型流感病毒在37 ℃时不能复制；减毒性是指病毒对小鼠和雪貂的致病性显著降低，无致死性[20]。这样的冷适应减毒活疫苗具备良好的安全性和有效性。研究发现，HA和NA是流感病毒基因组中最易发生变异的基因节段，而冷适应减毒活疫苗母本株中与冷适应及减毒特性相关的氨基酸突变位点位于除HA和NA以外的6个内部基因上，因此冷适应减毒活疫苗母本株的遗传性状比较稳定[21]。

2003年和2012年，美国相继批准上市了以鸡胚生产的三价流感减毒活疫苗和四价流感减毒活疫苗。冷适应减毒活疫苗的制备流程为分别以A型流感病毒A/Ann Arbor/6/60 （H2N2）和B型流感病毒B/Ann Arbor/1/66作为冷适应减毒活疫苗母本株，将其内部PB1、PB2、PA、NP、M和NS 6个基因与WHO推荐的流行株的HA和NA基因进行重配，进而获得流感冷适应减毒活疫苗。A/Ann Arbor/6/60 （H2N2）和B/Ann Arbor/1/66是由Maassab等[22]研制而成。Maassab等将这2株病毒在鸡胚上低温连续传代，使其具备冷适应性、温度敏感性和减毒性这3个特性，而以其为基因骨架制备而成的流感冷适应减毒活疫苗也具备相同的3个特性。这种冷适应性减毒疫苗可以通过滴鼻免疫，避免肌肉注射时所产生的疼痛，且能产生持久的体液免疫，以及良好的黏膜免疫和细胞免疫。除了美国外，俄罗斯以A/Leningrad/134/17/57 （H2N2）为基因骨架制备而成的流感冷适应减毒活疫苗也已成功应用达数十年之久[22]。

值得注意的是，目前传统的冷适应性流感减毒活疫苗大都以鸡胚为基质进行生产，存在一定的缺点。首先，病毒在鸡胚上进行连续传代，在其适应的过程中，HA往往容易发生突变，从而不能与流行株匹配完好，因此不能保证更好的免疫效果；其次，生产过程中存在外源因子污染的可能，收获的鸡胚尿囊液需要不断纯化去除外源因子及杂蛋白等；第三，生产周期长，生产过程繁琐，鸡胚来源受到限制，生产规模小，疫苗产量不足以应对流感大流行。因此，以传代细胞系为基质生产减毒活疫苗成为发展趋势。国内外用来生产流感疫苗的连续传代细胞系主要有犬肾细胞（MDCK细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和人视网膜母细胞瘤细胞（PER.C6）等[23-24]。目前美国MedImmune等公司以上述细胞为基质生产的流感疫苗已经上市，而且生产规模最大可达6000 L。此外有研究表明，采用非洲绿猴肾细胞生产的冷适应流感减毒活疫苗遗传性状稳定，有利于通过重配来生产减毒活疫苗。

流感减毒活疫苗的临床不良反应主要包括骨骼肌痛、渗出性中耳炎等，此外，在15～35个月的幼儿中应用冷适应减毒疫苗有增加哮喘的倾向，因此不建议3岁以下儿童使用。

2 新型季节性流感疫苗研究进展

2.1 细胞培养流感疫苗 与目前的流感疫苗生产方法相比，细胞培养流感疫苗的方法克服了现有生产工艺的许多不足，显著增加了疫苗产量，降低了生产成本和时间。过去60多年来，用于生产流感疫苗的病毒一直是在SPF鸡胚中培养的。然而一方面，并不是每枚鸡胚都可以用来生产疫苗，只有经过认证的养鸡厂才可以提供SPF鸡胚；另一方面，每枚SPF鸡胚一次只能注射一种病毒，但是典型的流感疫苗包含3种或4种病毒组分（即三价或四价流感疫苗），导致现有流感疫苗生产效率不高。现有方法需要大量合格的SPF鸡胚。以美国为例，为全美人口生产足够的流感疫苗需要多达数亿枚的SPF鸡胚。而细胞培养法则克服了上述缺点。此外，细胞培养法生产流感疫苗还有助于人类灵活应对流感大流行，用SPF鸡胚培养流感病毒，须提前对生产疫苗的数量做出精确规划，而在流感大流行期间，很难在短时间内购置生产疫苗所需的大量的SPF鸡胚，而细胞培养法则可以在短时间内制造出大批量流感疫苗来应对流感大流行疫情。此外，细胞生产的流感疫苗和鸡胚生产的流感疫苗在安全性和免疫原性方面没有显著差别。Reisinger等[25]评估了细胞生产的三价流感疫苗与鸡胚生产的三价流感疫苗在安全性和免疫原性方面的差别，他们在超过600名＜50岁的成人志愿者中开展临床试验，按照1∶1比例接种了细胞生产三价流感疫苗或鸡胚生产三价流感疫苗，结果未发现两种疫苗在安全性和免疫原性方面存在显著差异。此外，通过非洲绿猴肾细胞细胞生产的冷适应减毒活疫苗在成人滴鼻免疫试验中也被证明具有良好的安全性和免疫原性[26]。

2.2 病毒样颗粒疫苗 目前上市的季节性流感疫苗主要包括裂解疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗，这些疫苗都需要在鸡胚或哺乳动物细胞中增殖后才能产生足够的抗原，导致这些疫苗的生产过程需要消耗大量的时间和金钱，而流感VLPs疫苗可以有效解决传统疫苗的上述缺点[27]。

VLPs是由病毒结构蛋白组装且不含病毒遗传物质的空壳结构。由于VLPs不含病毒核酸，因此具有较高的安全性。此外，VLPs可以刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫，免疫原性强。目前通常选择昆虫杆状病毒表达系统来生产流感VLPs，所产生的VLPs与天然流感病毒形态相似。研究表明，H1N1亚型VLPs疫苗可展示与母本病毒HA和NA蛋白空间构象一致的抗原表位，进而诱导针对HA和NA的特异性抗体产生，目前已在临床试验中证明有效[28]。通过动物实验，Ross等[29]证明一种包括H1N1亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒和一种B型流感病毒的三价VLPs能够为机体提供针对不同季节性流感病毒的保护。通过皮肤贴片微针注射技术和动物实验，Quan等[30]证明含有海藻糖的H1N1亚型VLPs能够给机体提供长时间、高抗体滴度的免疫保护，小鼠在免疫1年后仍可抵抗H1N1亚型流感病毒的致死性攻击。Wang等[31]研究表明，通过滴鼻免疫的途径，嵌合鞭毛蛋白的H1N1亚型VLPs能够引起显著的黏膜免疫反应。目前Novavax公司的三价和四价季节性流感VLPs疫苗已进入人体临床试验阶段，但尚无季节性流感VLPs疫苗上市。

2.3 其他季节性流感疫苗 除了细胞培养疫苗和病毒样颗粒疫苗外，还有一些季节性流感疫苗也在研发中，包括复制缺陷型疫苗、添加 MF59佐剂的流感疫苗等。Wacheck等[32]发现NS1复制缺陷型H1N1季节性流感疫苗通过鼻内接种的方式接种志愿者后，志愿者体内可产生有效的流感中和抗体，且未发现除鼻腔炎症状或头痛等常见疫苗不良反应以外的其他不寻常的不良反应。Vesikari等[33]发现添加佐剂MF59的季节性流感疫苗可增强机体接种疫苗后的免疫应答水平。

3 结 语

自1918年西班牙流感大流行以来，每次流感大流行后都会出现新的季节性流感病毒株来取代或与之前季节性流感病毒株共同流行，当前季节性流感病毒由2种A型流感病毒（H1N1亚型流感病毒和H3N2亚型流感病毒）和B型流感病毒（Yamagata系和Victoria系）组成。季节性流感已成为影响全球的重要疾病负担，对公共卫生安全和经济社会的健康发展构成重要威胁。流感疫苗是应对季节性流感疫情的有效手段，虽然偶尔也会出现由于WHO推荐的疫苗株与各国当季实际流行的病毒株不匹配而引发的季节性流感疫情程度显著加重的事件，但总体上流感疫苗在应对季节性流感疫情和保护人类健康方面做出了不可磨灭的贡献。

在合理利用现有的三价和四价流感灭活疫苗以及流感减毒活疫苗的基础上，各国也在积极研发安全、高效和低成本的新型流感疫苗，包括细胞培养流感疫苗、VLPs疫苗等，未来各种新型流感疫苗的上市将会是对现有流感疫苗品种的有力补充，它们将与现有流感疫苗一道共同在人类防控季节性流感疫情的过程中发挥重要作用。