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生物防腐剂对食源性致病菌抑制效果的初步探究

2018-03-24钟俊良魏彩姣孙雪言赵喜红

食品研究与开发 2018年6期
关键词:苯甲酸钠蜡样植酸

钟俊良,魏彩姣,孙雪言,赵喜红

(武汉工程大学化工与制药学院,湖北武汉430073)

食品防腐剂在食品的生产过程中发挥着不可取代的作用,是重要的食品添加剂,对食品的保存和风味的保持发挥着关键作用,是目前食品以及相关行业研究的重点[1]。防腐剂主要有天然生物防腐剂和人工合成防腐剂两大类,天然生物型防腐剂是通过抑制微生物在食品中的生长繁殖和抑制食品中氧化、酶促等反应来发挥作用的[2],而日常生活中用的化学防腐剂大多都是人工合成的,如苯甲酸钠和山梨酸钾等。由于化学类防腐剂具有潜在毒性,在一定程度上损害人体健康,所以天然生物防腐剂因安全无毒和抗菌性好等特点而逐渐成为当前的研究热点。

乳酸链球菌素(Nisin)作为一种新型的细菌素天然生物防腐剂,具有安全、无毒的特性而广泛应用于肉制品、乳制品、腌渍食品等。Nisin对大部分的G+菌有比较强的抑制效果,比如耐热腐败菌、产芽孢杆菌、生孢梭菌等细菌,但对大部分G-菌及真菌无抑制效果[3]。纳他霉素是微生物源天然生物防腐剂中的经多种霉菌发酵产生的环内酯类抗生素[4]。纳他霉素相比较于其他的抑菌素,对哺乳动物细胞毒性极低,已被批准可作为食品防腐剂和抗真菌剂应用于肉类、乳制品等食品的加工贮藏[5]。植酸是从植物的种子里提取出来的纯天然无毒物质,对绝大多数金属离子有极强的螯合能力,能够抑制大部分G+及其芽孢的生长与繁殖[6]。

本实验依据GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定的食品添加剂最大使用量(0.1%),通过控制变量研究上述天然生物防腐剂在不同浓度下分别对单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)的抑制效果,同时使用苯甲酸钠作为对照组比较化学防腐剂与生物防腐剂的抑菌效果,以期为食源性致病菌的安全控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Nisin、胰蛋白胨、酵母膏提取物:青岛海博生物技术有限公司;纳他霉素:河北大唐生物工程有限公司;植酸:广州全奥化工产品有限公司;苯甲酸钠:青岛丰泰化工有限公司;酒精、医用酒精:广州全奥化工产品有限公司;氯化钠:国药集团化学试剂有限公司;琼脂:北京奥博星生物技术有限责任公司;无菌水:武汉工程大学实验室。

1.2 仪器与设备

CHA-SA数显恒温振荡器:常州市国旺仪器制造有限公司;DSX-280KB30手提式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2FB超净工作台:上海尚道仪器制造有限公司;ME104E/02电子天平:梅特勒-托利多仪器有限公司;SPX-150BSH-Ⅱ生化培养箱:上海新苗医疗器械制造有限公司;OHG-9073BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱:上海新苗医疗器械制造有限公司;HH-S2智能数显恒温水浴锅:巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 试验菌种

本试验中所用标准菌株均来源于美国模式培养物保藏所(ATCC),包括单核细胞增生李斯特菌(ATCC 19114)、蜡样芽孢杆菌(ATCC 13061)、大肠杆菌 O157:H7(ATCC 43895)。

1.4 培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L):胰蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化钠10 g,琼脂15 g;牛肉膏蛋白胨液体培养基(g/L):胰蛋白胨 10 g,酵母膏 5 g,氯化钠 10 g。

1.5 方法

1.5.1 细菌活化及菌悬液的制备

菌株单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌O157:H7保藏在-20℃、50%的甘油中,用移液枪取0.1 mL保藏菌液接入装有9.9 mL液体培养基的试管中,置于37℃的摇床上130 r/min震荡培养12 h(约108CFU/mL),于4℃的冰箱中保存备用。

1.5.2 单一防腐剂对3种食源性致病菌抑制作用研究

将Nisin、纳他霉素、植酸和苯甲酸钠按照GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定的最大添加量稀释成不同的质量浓度,添加到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,分别接入1 mL上述保存的菌种,各防腐剂最终浓度如表1所示。将已接种试管置于37℃的培养箱中隔夜培养12 h后,用稀释涂布平板计数法进行计数。

表1 防腐剂的最终浓度Table 1 The final concentration of preservatives

1.6 分析方法

使用平板计数法测定得出菌落数后,用致病菌的抑菌率来评价各个防腐剂对致病菌的抑菌效果。抑菌率计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 单一防腐剂对3种食源性致病菌的抑制效果

2.1.1 不同浓度的Nisin对致病菌的抑制效果

在国标浓度范围0.1%内,Nisin对3种食源性致病菌有不同程度的抑制作用,结果见图1。

图1 不同浓度的Nisin对单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌率Fig.1 Depression effect of the different density of Nisin on Listeria monocytogenes,Bacillus cereus and E.coli O157:H7

由图1可知,Nisin对单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的抑制效果最明显,当Nisin质量浓度为0.01%时,单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌率分别为99.92%和98.78%,而大肠杆菌O157:H7的抑菌率只有46.07%。当Nisin浓度达到0.02%时,单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的抑制率已达100%,但大肠杆菌O157:H7的抑菌率只有52.81%。当浓度达到国标0.1%时,大肠杆菌O157:H7抑制率只有61.12%。据有关文献报道,当Nisin的浓度高于10 μg/mL(0.000 1%)时对单增李斯特菌有一定的杀菌作用,当其浓度高于150 μg/mL(0.015%)时,几乎所有的单增李斯特菌都被杀死[7],与本试验结果相符合。虽然Nisin对大肠杆菌O157:H7的抑制效果不理想,但随着Nisin浓度的增加,其对大肠杆菌O157:H7的抑制效果缓慢提高。

本文的水系统指的是城市人工水系统,包括与城市水资源开发利用有关的水源取水、供水、输水、用水、排水、污水处理与回用等环节。除了各个环节基础设施的建造需要消耗大量的物资和能源之外,水系统在运行过程中也需要大量的能源投入,例如城市供水管网的输配水能耗,污水处理厂进行污水处理的能耗等。在城市水系统巨大能源消耗的背后是可观的碳排放。在我国,已有研究和经验表明给排水行业是城市的用电大户,目前我国大多数供水企业的平均耗电量占总制水成本的20%~30%,城市水系统运行中的碳排放不容忽视。

2.1.2 不同浓度的纳他霉素对致病菌的抑制效果

不同浓度的纳他霉素对致病菌的抑制效果见图2。

图2 不同浓度的纳他霉素对单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌率Fig.2 Depression effect of the different density of Natamycin on Listeria monocytogenes,Bacillus cereus,and E.coli O157:H7

从图2可得,当浓度为0.01%~0.05%时,纳他霉素对3种致病菌的抑菌率在20%内上下起伏,可能是平板计数法存在一定的测量误差所致,可以认为在该浓度范围内纳他霉素无法抑制3种致病菌。当浓度到达0.1%时,3种致病菌的抑菌率明显提高,分析原因可能是由于较高浓度的纳他霉素会在一定程度上改变了膜内外渗透压,从而抑制住了部分细菌的生长。

2.1.3 不同浓度的植酸对致病菌的抑制效果

不同浓度的植酸对致病菌的抑制效果见图3。

图3 不同浓度的植酸对单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌率Fig.3 Depression effect of the different density of Phytic acid on Listeria monocytogenes,Bacillus cereus,and E.coli O157:H7

随着植酸浓度的变化,3种致病菌的数量级虽然没有改变,但致病菌的抑菌率随着浓度的升高而表现逐渐提高的趋势。当植酸的浓度为0.01%时,蜡样芽孢杆菌的抑菌率为9.43%,但单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌率为0%。当浓度提高到0.02%时,植酸对3种致病菌表现出微弱的抑制效果。当浓度达到0.03%以后,植酸对3种致病菌的抑制效果逐渐提高,其中对单增李斯特菌的抑制效果最好,而对大肠杆菌O157:H7的抑制率最低,分析原因可能是因为大肠杆菌具有极强的耐酸性[8],相对于其他两种致病菌更适合生存在植酸的低pH值环境中,另外有文献报道了植酸对大肠杆菌O157:H7的最小抑制浓度为0.4%[9],说明了高浓度的植酸才能有效抑制大肠杆菌O157:H7的生长。其次,植酸极强的螯合能力能够抑制大部分G+菌及其芽孢的生长与繁殖。但从实验结果来看,植酸的抑菌效果不佳,可考虑与Nisin进行复配从而提高抑菌效果。有研究表明,1 mg/mL的Nisin与1.5 mg/mL的植酸进行复配可以有效抑制菌液浓度在106CFU/mL的食源性致病菌[10]。

2.1.4 不同浓度的苯甲酸钠对致病菌的抑制效果

不同浓度的苯甲酸钠对致病菌的抑制效果见图4。

由图4可知,随着苯甲酸钠的浓度增加,3种致病菌的抑菌率也逐步增加,但整体抑菌效果不佳。本试验探究了当苯甲酸钠浓度达国家标准0.1%时,单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和蜡样芽孢杆菌的抑菌率只有66.15%、54.41%和45.19%。据相关文献报道,当苯甲酸钠浓度为0.3%时才能显著地抑制住大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长[11],而杨荣杰[12]也通过实验得出苯甲酸钠对蜡样芽孢杆菌的最小抑制浓度为1%,这说明了苯甲酸钠的浓度需要超过国家标准浓度才能够抑制住食源性致病菌的生长。

图4 不同浓度的苯甲酸钠对单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌O157:H7的抑菌率Fig.4 Depression effect of the different density of Sodium benzoate on Listeria monocytogenes,Bacillus cereus,and E.coli O157:H7

2.2 等质量浓度的不同防腐剂对3种食源性致病菌的抑制效果

为了比较天然生物防腐剂与化学类防腐剂对3种食源性致病菌的抑菌效果,现将等质量浓度的四种防腐剂对致病菌的抑制率汇总在图5中。

从图5A可知,当质量浓度为0.01%时,Nisin对单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的抑制率接近百分之百,但是对大肠杆菌O157:H7的抑制率只有46.07%,由此可见较低浓度的Nisin依然有效抑制G+菌生长,而且在此浓度下Nisin对3种菌的抑菌效果要比其他3种防腐剂理想。相反地,在0.01%浓度下的植酸对3种致病菌的抑制效果极不理想,而且对单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7有促生长作用,分析原因可能是因为植酸是能够改善细菌细胞膜对氧气的通透性、增加物质之间的传递性,从而导致了细菌的快速生长和繁殖[13]。

图5 等质量浓度的不同防腐剂对3种食源性致病菌的抑制效果Fig.5 Antibacterial activities of different food preservatives at the same concentration against three species of bacteria

随着防腐剂浓度的升高,不同防腐剂对3种致病菌的抑菌趋势基本保持一致,抑菌效果最好的是Nisin,其次是苯甲酸钠、植酸和纳他霉素。当浓度达0.1%时,从图5D可知纳他霉素对大肠杆菌O157:H7的抑菌率超过了植酸,但是对其他两种致病菌的抑菌率依然低于植酸。

3 讨论

以上结果表明,当Nisin浓度为0.01%时,对单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌率接近百分之百,但对大肠杆菌O157:H7的抑菌效果较差,当Nisin达最高浓度为0.1%时,大肠杆菌O157:H7的抑菌率只有61.12%,这结果也说明了即使Nisin对G-菌的抑制效果不理想,随着浓度的增加Nisin对G-菌的抑制效果将缓慢提高。潘丽军[10]等在研究Nisin对G-菌抑制效果的实验中得出其最小抑菌浓度为5 mg/mL(0.5%),由此可见,只有高浓度的Nisin才能够有效抑制G-菌的生长。

虽然苯甲酸钠的抑菌效果仅次于Nisin,但当其浓度达到最高使用量0.1%时,对单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和蜡样芽孢杆菌的抑菌率只有66.15%、54.41%和45.19%,并不能很好地抑制细菌生长。在2.1.4也讨论了苯甲酸钠的最低抑制浓度已超过国家规定的食品添加剂最大使用量,虽然不同食品中抑菌因素是多方面的综合效果,但是基于纯培养体系的实验结果,不建议单独使用苯甲酸钠作为食品防腐剂应用到食品当中。

纳他霉素是一种对真菌具有显著抑制效果的多烯大环内酯类抗生素,目前大多数对纳他霉素的文献报道都集中在抗真菌以及酵母菌方面,几乎没有关于纳他霉素对细菌抑制作用的报道。因此,本文将纳他霉素列为其中一种生物型防腐剂,探究纳他霉素对食源性致病菌的抑菌作用。从2.1.2的试验结果可得,低浓度的纳他霉素对致病菌几乎没有抑制作用,但当浓度提高到0.1%时,纳他霉素开始表现出抑制作用。有文献报道,纳他霉素通过与细胞膜中甾醇结合形成一种复合物,该复合物能够改变细胞质膜的性质,从而破坏其渗透性及通透性,并达到抑菌效果[14]。由于细菌细胞膜内无甾醇,分析本实验中纳他霉素对致病菌表现出的抑制效果可能是因为高浓度的纳他霉素改变了适合致病菌生长繁殖的环境条件或者改变了膜内外渗透压,从而抑制住了一部分致病菌的生长,具体的抑制机理有待进一步的研究。

4 结论与展望

试验结果表明,4种防腐剂中Nisin对致病菌的抑菌效果最好,其中对单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的最小抑制浓度为0.01%,但无法得到对大肠杆菌O157:H7的最小抑制浓度,达最高浓度0.1%时的抑菌率只有61.12%;在浓度范围0.01%~0.05%,纳他霉素和植酸对致病菌的抑制效果并不理想,其中纳他霉素基本对致病菌无抑制作用,当两者浓度提高到0.1%时,对致病菌的抑制作用有明显的提升;苯甲酸钠的抑菌效果仅次于Nisin,但无法在实验范围内得出对3种致病菌的最小抑菌浓度。综合上述结论,纳他霉素、植酸和苯甲酸钠在单独使用的情况下无法达到抑制细菌生长的目的,因此下一步工作可将其复配并应用于真实食品样品中进行验证。

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