腺苷微生物发酵生产技术研究

腺苷是一种遍布人体细胞且具有重要生理功能的内源性嘌呤核苷，对心血管系统和肌体其它系统及组织均有生理作用。目前，腺苷的生产方法主要有RNA水解法、化学合成法和生物发酵法。日本早在70年代就开始了发酵法生产腺苷的研究，并取得了一系列成果，已进入大规模工业生产阶段。国内发酵法生产腺苷的起步较晚，随着腺苷的应用越来越广泛，有必要对其进行更深入的研究。

目前，国内腺苷微生物发酵生产技术主要集中于研究菌种选育、发酵工艺。如中国专利CN200510063223.3公开了一种微生物发酵法生产腺苷的生产工艺，生产工艺为：用腺苷生产菌作为生产菌种，经过斜面菌种培养及种子罐扩大培养后，接入发酵罐进行发酵生产得到发酵液，发酵液通过无机膜过滤、浓缩、结晶、离心、重结晶、离心、干燥、粉碎整粒工序制得成品。CN200510055696.9提供了一种腺苷产生菌枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)JSIM-1025，还提供一种生产高产量腺苷的发酵方法，利用包括1.8%的最适浓度酵母膏的最佳培养基组分，最适pH6.5和40%的最适溶氧控制范围的发酵条件，在37℃下发酵60 h后的产苷能稳定在23 g/L以上。CN201310301844.5公开了一种通过流加有机氮源提高腺苷发酵产量的方法。该方法以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGL为生产菌株，通过在产苷阶段补充氮源的补料策略实现了枯草芽孢杆菌XGL发酵生产腺嘌呤核苷的高产。该发明的方法优势在于，在腺嘌呤核苷发酵生产的整个过程中，氮源的浓度不断降低，发酵过程中流加氮源可以保持氮源的充足，在减少反馈抑制的同时，使腺嘌呤核苷的产量达到42.4 g/L，产量提高26%，发酵周期压缩至50 h左右。CN201310097396.1公开了一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法。该方法以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGL为生产菌株，以梯度pH的顺序控制方式分批发酵生产腺苷，在菌体生长阶段控制pH为6.7～7.0，在达到一定菌体量后控制pH为6.0～6.3，发酵60 h，腺苷产量为18.2 g/L。该方法可以提高腺苷的产量，发酵过程无需增加额外设备，适合于工业化生产。CN201310561917.4公开了一种膜生物反应器菌株诱变培养及腺苷发酵方法，其采用酶抑制剂利巴韦林、甲氨喋呤、别嘌呤和乙嘧酚磺酸脂协同诱变枯草芽胞杆菌，在膜生物反应器中高密度培养，经过一到两次诱变得到产腺苷8 g/L，尿苷6 g/L的枯草芽胞杆菌菌株。刘剑（2012）对腺苷发酵过程中不同溶解氧浓度进行研究，通过对发酵终点丙酮酸的检测，发现枯草芽孢杆菌在低溶氧状态下比高溶氧状态下积累更多的丙酮酸，在此基础上，提出两阶段控制策略，最终腺苷积累量达到20.1 g/L，为腺苷工业生产提供理论参考。李金鑫（2015）以B.subtilis DI3-243为出发菌株,利用N+离子束注入和硫酸二乙酯(DES)为诱变剂进行单因子以及复合诱变处理,进行高产腺苷菌株的选育和发酵条件的优化等研究。从中筛选出产苷水平高且性状稳定的菌株，其中的DI4-24R-37菌株产苷15.84 g/L，其回复突变率明显下降。在500 L发酵罐放大试验，发酵72 h产苷28.9 g/L。张命龙等（2016）通过摇瓶液体培养的方法，以菌丝体生物量为主要考察指标，筛选蝙蝠蛾拟青霉PH-2菌株液体发酵的培养基成分和条件。进一步采用正交试验，以菌丝体生物量和腺苷含量为联合指标，确定PH-2菌株液体发酵高产菌丝体和腺苷的培养基配方。通过试验获得的最佳配方为：玉米淀粉40 g/L，葡萄糖5 g/L，玉米浆25 g/L，硫酸镁·7H2O 1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸锌1.5 g/L，维生素B125 mg/L；培养条件为：初始pH 6.0，装液量150 mL/500 mL，接种量8%(V/V)，温度26℃，转速120 r/min,培养7 d。在该工艺下菌丝体生物量达到25.2 g/L。应用高效液相色谱(HPLC)法，检测到菌丝体中腺苷质量分数为2.76 mg/g。

腺苷生物发酵法具有生产成本低、反应条件温和、原料来源广泛等优点，因此将会是今后生产的发展方向。针对现有腺苷生产菌生产水平低、副产物高的突出问题，研究人员应在代谢工程理论指导下，对腺苷的合成代谢网络进行全面分析和研究，从中心代谢、支路代谢和能量代谢等多个角度对腺苷生产菌进行多途径的协同修饰和调控，构建出生产能力更高的腺苷生产菌；并对腺苷生物合成途径进行代谢流分析，以此为依据对发酵条件进行优化，确定最佳的发酵配方和控制条件。