脯氨酰异构酶1沉默抑制缺氧/复氧H9c2心肌细胞凋亡①

郭红雨 段永珂 何瑞利 程冠昌

(河南大学淮河医院心内科，开封 475000)

心肌缺血是造成心脏病患者死亡的主要原因[1]，及时恢复心脏血液供应是防治缺血损伤最有效的措施，然而缺血再灌注造成的心肌细胞损伤是亟待解决的问题[2]。细胞凋亡被认为是心肌缺血再灌注损伤的重要病理基础，细胞凋亡的数量决定了心肌缺血再灌注损伤的严重程度[3]。因此，阐明调控缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡的机制，对防治缺血再灌注损伤具有重要意义[4]。

肽基脯氨酰顺反异构酶1(Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase,NIMA-interacting 1，Pin1)参与多条信号通路的调控，在心血管疾病发病过程中发挥重要作用[5]，此外，Pin1在心肌肥大和心脏衰老中也具有重要作用[6-8]。研究报道Pin1可诱导细胞凋亡[9-11]。然而，Pin1蛋白在缺氧复氧心肌细胞中的作用未见报道，因此本文以大鼠H9c2细胞为对象，研究Pin1对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠胚胎H9c2心肌细胞系购自中国科学院上海细胞库；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；TRIzol试剂盒和LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Pin1抗体购自美国Cell Signaling公司；兔抗大鼠Bcl-2抗体、兔抗大鼠Bax抗体和兔抗大鼠GAPDH抗体购自中杉金桥生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Pin1 siRNA(序列：TACGTCCAAGGTC-GGGCAGGAAGA)、scramble siRNA(序列：CAACCCGCTCCAAGGAATCG)均购于美国Invitrogen公司；Caspase-3活性检测试剂盒购自南京建成有限公司；Pin1引物、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。

1.2主要方法

1.2.1细胞培养 细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%融合时进行传代。

1.2.2细胞分组及处理 将细胞分为空白对照组、缺氧/复氧(H/R)组、Pin1 siRNA组、scramble siRNA(scramble)组。空白对照组细胞在37℃、5%CO2和95%空气的培养箱中正常培养；缺氧/复氧组细胞在无血清无糖的DMEM培养基，95%N2和5%CO2培养3 h后，于含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2和95%空气中培养1 h[12]；Pin1 siRNA组转染Pin1 siRNA 24 h后进行缺氧/复氧处理；scramble组转染非特异性siRNA后进行缺氧/复氧处理。

1.2.3细胞转染 将细胞接种于6孔板，待汇合率达90%，用LipofectamineTM2000将100 nmol/L Pin1 siRNA转染细胞，转染24 h后进行缺氧/复氧处理。

表1引物序列

Tab.1Sequencesofprimers

NamePrimersequence(5′⁃3′)Product(bp)Pin1Forward：CCTAAAATGACTGGGAGGGGG125Reverse：TCCACTGCCCTTCTGAAGTCGAPDHForward：ACCACAGTCCATGCCATCAC419Reverse：TCCACCACCCTGTTGCTGTA

1.2.4MTT法检测细胞存活率 取对数生长期的H9c2细胞接种于96孔板(3×104个/孔)，培养24 h后，每孔加20 μl MTT溶液(5 g/L)，继续培养4 h，弃去孔内液体，加150 μl DMSO，摇床10 min充分溶解结晶物后，用酶标仪检测490 nm的光吸收值A。细胞存活率(%)=(各组A490值/空白对照组A490值)×100%。

1.2.5Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡率和坏死率 培养并收集各组细胞，用冰PBS清洗后，加入500 μl Binding Buffer调整细胞浓度至1×106个/ml，分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温避光反应10 min，进行流式细胞术检测。

1.2.6Caspase-3活性的检测 收集各组细胞，加入裂解液，冰浴裂解15 min，4℃、15 000 r/min离心5 min，10 μl，加入Ac-DEVD-pNA 10 μl，37℃孵育2 h，用酶标仪测定405 nm的光吸收值A405。样品的A405扣除空白对照的A405为样品中Caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度。按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书，测定并绘制标准曲线。根据标准曲线，对比计算出样品中催化产生的pNA量计算Caspase-3活性。

1.2.7RT-qPCR实验 用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。

1.2.8Western blot检测蛋白表达 裂解细胞后，用BCA法定量，取20 μg蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移至聚偏氟乙烯膜上，放入5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗大鼠Pin1抗体(1∶1 000)、Bcl-2抗体(1∶200)、Bax抗体(1∶200)、Caspase-3抗体(1∶500)4℃过夜。漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶3 000)孵育2 h。TBST漂洗后用ECL显色观察。

2 结果

2.1Pin1在缺氧/复氧H9c2细胞中表达升高 由图1所示，和空白对照组相比，缺氧/复氧H9c2细胞中Pin1的mRNA和蛋白表达显著升高(PmRNA=0.000；P蛋白=0.003)。

2.2Pin1 siRNA转染抑制Pin1表达 与对照组比，scramble siRNA组Pin1 mRNA和蛋白表达无显著性差异(PmRNA=0.839；P蛋白=0.696)，Pin1 siRNA组Pin1的mRNA和蛋白表达显著降低(均P=0.000)，见图2。

图1 Pin1 RT-qPCR和Western blot检测Pin1的表达Fig.1 RT-qPCR and Western blot detection for Pin1 expression(±s,n=3)Note:A.Pin1 mRNA expression;B.Pin1 protein expression.*.P<0.05,vs control group.

图2 Pin1 siRNA转染结果Fig.2 Pin1 siRNA transfection results (±s,n=3)Note:A.Pin1 mRNA expression;B.Pin1 protein expression.*.P<0.05 vs other groups.

图3 Pin1 siRNA对细胞存活率的影响Fig.3 Effects of Pin1 siRNA on cell viability of H9c2 cells(±s，n=6)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.3Pin1 siRNA增加缺氧/复氧H9c2细胞存活率 MTT结果显示，和对照组相比，缺氧/复氧组细胞的存活率显著降低(P=0.000)；而Pin1 siRNA转染后，缺氧/复氧H9c2细胞的存活率显著增加(P=0.001)，见图3。

2.4Pin1 siRNA对缺氧/复氧H9c2细胞凋亡和坏死的影响 实验结果表明，和对照组相比，缺氧/复氧组细胞凋亡率显著增多(P=0.000)，坏死率无显著差异(P=0.103)；Pin1 siRNA组的细胞凋亡率明显少于缺氧/复氧组(P=0.000)，坏死率无显著差异(P=0.789)，见图4。

图4 流式细胞术检测Pin1 siRNA对H9c2细胞凋亡率和坏死率的影响Fig.4 Effects of Pin1 siRNA on cell apoptotic rate (%) and necrotic rate (%) of H9c2 cells detected by flow cytometry(±s，n=3)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

图5 Pin1 siRNA对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响n=3)Fig.5 Effects of Pin1 siRNA on protein expression of Bcl-2 and Bax(±s，n=3)Note:A.The protein expression of Bcl-2 and Bax；B.Comparison of Bcl-2/Bax.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

图6 Pin1 siRNA对Caspase-3活性影响Fig.6 Effects of siRNA on activity of Caspase-3(±s，n=6)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.5Pin1 siRNA对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响Western blot检测凋亡相关蛋白表达的变化，结果如图5所示。和对照组相比，缺氧/复氧组细胞Bcl-2蛋白表达降低、Bax表达增高，Bcl-2/Bax降低(均P=0.000)。和缺氧/复氧组相比，Pin1 siRNA组Bcl-2表达升高，Bax表达减少，Bcl-2/Bax升高(均P=0.000)。

2.6Pin1 siRNA抑制Caspase-3活性的影响 和对照组相比，缺氧/复氧组细胞Caspase-3活性增加(均P=0.000)。和缺氧/复氧组相比，Pin1 siRNA组细胞Caspase-3活性显著降低(均P=0.000)，见图6。

3 讨论

Pin1是一个进化上保守的肽基脯氨酰异构酶，能够特异性识别和结合特定的磷酸化蛋白，调节蛋白质结构，从而改变磷酸化蛋白质的功能，影响细胞过程[13]。Pin1在调节心脏的病理生理过程中起着举足轻重的作用[14]。研究表明，Pin1调控心肌肥厚信号[7]，可通过调节磷酸化分子的活性决定肥大心肌细胞的大小[6]。Pin1过表达可抑制心脏祖细胞衰老与死亡[8]，而抑制Pin1能够减轻心肌纤维化和功能障碍[15]。本实验通过心肌细胞缺氧/复氧模拟心脏缺血再灌注损伤，检测Pin1对缺氧/复氧心肌细胞的作用。结果表明，Pin1在缺氧/复氧大鼠心肌细胞高表达，提示Pin1可能在心肌细胞缺氧/复氧损伤中发挥重要作用。为进一步探索Pin1对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响，我们用Pin1 siRNA沉默Pin1的表达，检测了Pin1 siRNA对缺氧/复氧损伤心肌细胞的作用。结果发现Pin1沉默能够显著增加缺氧/复氧H9c2细胞存活率，提示Pin1沉默可能对心肌细胞缺氧/复氧损伤有重要的保护作用。由于只用了一种siRNA，不能排除脱靶效应，但是图2 中Pin1 siRNA转染结果显示，和对照组及scramble siRNA组比较，Pin1表达下降了约75%，其功能性是可以保证的。

缺血再灌注可诱导心肌细胞凋亡而使细胞死亡[16]。近年来，研究证实Pin1在调节细胞凋亡中发挥重要作用。Wang等[9]研究发现Pin1可调节高剂量酒精诱导的小鼠心肌细胞凋亡。另据文献报道Pin1沉默可抑制高氧诱导的A549细胞凋亡[17]。然而，Pin1是否参与缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡仍不明确，有待于进一步研究证实。本研究发现Pin1沉默能降低缺氧/复氧H9c2细胞凋亡率。Bax、Bcl-2和Caspase-3是线粒体凋亡信号通路中的下游分子[18]。Bcl-2家族是一种凋亡相关基因，通过调节线粒体膜的通透性在细胞凋亡中发挥重要作用[19]，其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素[20]。Bcl-2调节开启线粒体通透性转换孔发挥抗凋亡作用，而Bax发挥促凋亡作用。Bcl-2/Bax的平衡影响凋亡的发生[21]。Caspase-3是Caspase依赖途径中最终被主要激活的凋亡效应酶，其活化在细胞凋亡的启动过程中起着核心作用[22]，能够水解多种重要的蛋白而导致细胞凋亡[23]。本试验发现Pin1 siRNA能够显著上调Bcl-2表达，下调Bax，增加Bcl-2/Bax比值，降低Caspase-3活性，抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。

综上，本研究在细胞水平证实，Pin1 siRNA可通过上调Bcl-2、下调Bax，降低Caspase-3活性，抑制了缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡，为基因治疗缺血性心脏病提供了新的思路。

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