二烯丙基二硫对人白血病细胞增殖和钙网蛋白表达的影响

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(1.湖南中医药高等专科学校护理系，湖南 株洲412000；2.湖南中医药高等专科学校附属第一医院；3.南华大学医学院肿瘤研究所)

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide,DADS)是大蒜中的一种脂溶性的有效成分，对乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、胃癌和白血病等多种肿瘤均有明显的抑制作用，是一种很有开发潜力的抗肿瘤药物[1-3]。钙网蛋白(calreticulin,CRT)是一种普遍存在且高度保守的内质网钙结合蛋白，主要分布在细胞的内质网腔。人类CRT基因定位于p13.2-p13.3，具有调节钙平衡、协助蛋白质的折叠和加工、参与抗原提呈、血管发生、胚胎发育及凋亡的调节等多种生物学功能[4]。近年来研究表明，CRT在多种肿瘤中特异性表达增加，与肿瘤的发生发展、诊断、预后判断以及治疗密切相关[5]。本研究观察DADS对人白血病细胞分化的影响，并从CRT的角度探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1实验材料人类急性髓性白血病HL-60细胞系(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所)。DADS(Fluka公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程公司)、DMSO(Solarbio公司)、MTT(Amresco公司)。BCA蛋白定量检测试剂盒(碧云天公司产品)、ECL发光检测试剂盒和显影定影试剂盒(北京康为世纪有限公司)。Lipofectamine2000(invitrogen公司产品)、反转录试剂盒(Fermentans公司)、TRIZOL试剂(Invitrogen公司)。兔抗人Calreticulin一抗及相应的羊抗兔二抗(美国proteintech公司)、miRNA质粒(Santa crzu公司)。二氧化碳细胞培养箱(Heal Force公司)、酶联免疫检测仪(Thermo公司)、垂直电泳仪及电泳槽及转膜系统(美国BIO-RAD公司)。CRT siRNA由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.2细胞培养用含10%小牛血清的1640培养基培养于温度37 ℃、5%CO2孵箱、一定饱和湿度中常规悬浮培养HL-60细胞，并于2～3天换液传代，观察细胞处于对数生长期即用于实验。

1.3药物处理与分组用培养基稀释DADS到所用的浓度，根据本实验室的前期结果，在本实验中采用1.25 mg/L DADS处理HL-60细胞，并培养至预定时间。

1.4 Calreticulin siRNA细胞瞬时转染将细胞按105个/mL量铺于细胞培养瓶内，待细胞密度生长至80%以上时，进行细胞转染。先取转染试剂12 μL加入至300 μL无血清无双抗培养基中配制成A液，再取4 μg质粒加入到无血清无双抗的培养基中，配制成B液。A、B液混合，室温反应15 min后，加入无血清无双抗的培养基4.5 mL，将细胞原有上清吸弃。以5′-GCAGACAAGCCAGGAUGCACGCUU U-3′(正义链)，5′-AAAGCGUGCAUCCUGGCUUGUCUGC-3′ (反义链)为靶序列构建CRT siRNA，按照Lipofectamine 2000的使用说明，将CRT siRNA转入HL-60细胞，培养3 h，吸取上清，加入胎牛血清至终浓度为10%，37 ℃ 5% CO2培养48 h后进行后续检测实验，评判转染效果[6]。

1.5 MTT检测收集对数期HL-60细胞，调整细胞悬液浓度，按5×104/孔接种于96孔板中。置于5%CO2，37 ℃培养箱孵育24～48 h，至细胞单层铺满孔底。处理结束后，每孔加入20 μL MTT 溶液，继续培养4 h。终止培养，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长为570 nm下测量各孔的吸光值。

1.6实时定量PCR检测引物合成从NCBI中下载人CRT基因序列，引物设计采用Primer 5.0软件，引物序列见表1。收集生长状态良好的目的细胞，提取RNA并反转录得到cDNA，并以该cDNA为模板，用针对目的基因设计合成的Real-time PCR引物进行扩增，以检测细胞中目的基因的表达。设定程序为两步法Real-Time定量，预变性95 ℃，15 s，之后每一步变性95 ℃，15 s，退火延伸58 ℃，30 s，共40个循环，每次在延伸阶段读取荧光值，总反应体系为10 μL。

表1 引物序列

1.7 western Blot检测将经过处理的细胞，于1 000 rpm，5 min离心后再收集，用预冷的PBS洗涤，加入细胞裂解液，摇床上摇动50～60 min，于12 000 rpm 4 ℃离心20 min，收集上清液。采用BAC法测定总蛋白质浓度。据所检测分子量的大小来配置其相应浓度的胶。配置分离胶，在上面封水放置于37 ℃温箱中孵育30 min，取出后观察分离胶凝固马上再灌上层的积层胶，并迅速插入梳子，4 ℃过夜。取出已灌好的胶，拔掉梳子，将玻璃板安装好后放置于电泳槽内。根据所测的蛋白浓度决定每孔所加的蛋白量。开始电泳，分离胶85 V，20-30 min，积层胶140 V，10 min。将已经电泳好的胶转到经PVDF膜上，根据不同蛋白分子量的大小选择合适的电压和电流或转膜时间。考马斯亮蓝染液中染色后并观察，将膜放置于丽春红染液中染色5～10 min后观察。将膜用5%的脱脂牛奶中封闭2 h，再加入一抗，再放置到4 ℃孵育过夜；再用TBST洗。加相应的二抗室温孵育2 h，TBST洗。取出膜在暗室中ECL中发光，显影，定影。为确保每组所加蛋白为等量，同一张膜显影后重新封闭再孵一抗β-actin。

2 结 果

2.1 DADS对人白血病HL-60细胞增殖的影响采用MTT法检测细胞的增殖水平，结果显示：与对照组比较，DADS处理24、48和72 h组细胞的殖水平均显著性降低，呈现时间依赖性(均P<0.05)。见表2。

表2 DADS对人白血病HL-60细胞增殖的影响(OD值)

与对照组比较，aP<0.05；与0 h组比较，bP<0.05；与24 h组比较，cP<0.05；与48 h组比较，dP<0.05

2.2 DADS对人白血病HL-60细胞CRT表达的影响采用实时定量PCR和Western blot检测细胞中CRT的表达，结果显示：与对照组比较，DADS处理24、48和72 h组细胞中CRT的mRNA和蛋白表达均显著性降低，呈现时间依赖性(均P<0.05，见图1)。

2.3 SiRNA干扰CRT对DADS诱导HL-60细胞增殖的影响CRTsiRNA瞬时转染HL-60细胞48 h后，实时定量PCR和western blot检测CRT mRNA和蛋白的表达，结果显示：与对照组比较，siRNA瞬时转染显著降低了CRT mRNA和蛋白的表达(P<0.05)，与DADS具有协同效应(见图2)。采用MTT法检测细胞的增殖水平，结果显示：与对照组比较，siRNA瞬时转染显著降低了细胞的增殖水平(P<0.05)，与DADS具有协同效应(见图3)。

图1 DADS对人白血病HL-60细胞CRT表达的影响与对照组比较，*P<0.05；与24 h组比较，#P<0.05；与48 h组比较，△P<0.05

3 讨 论

大量研究显示DADS具有抗肿瘤的作用，是一种具有开发潜力的新型抗癌药物。白血病是造血系统的恶性疾病，它是来源于造血干细胞的克隆性的恶性疾病，病变的细胞发生分化障碍、增殖失控或凋亡阻碍，而大量的聚集在人类的骨髓和造血系统中，然后抑制其正常的造血功能并能浸润到淋巴组织、脾脏、肝脏等组织器官中。本研究的结果显示，1.25 mg/L的DADS处理HL-6细胞24、48和72 h组后，细胞的增殖水平均显著性降低，提示DADS能抑制白血病细胞的增殖，具有抗白血病的作用，但其机制不清。

图2 CRT mRNA和蛋白的表达与对照组比较，*P<0.05；与DADS组比较，#P<0.05；与siRNA组比较，△P<0.05

图3 SiRNA干扰CRT对DADS诱导HL-60细胞增殖的作用与对照组比较，*P<0.05；与DADS组比较，#P<0.05；与siRNA组比较，△P<0.05

CRT是一种普遍存在且高度保守的内质网钙结合蛋白，主要分布在细胞的内质网腔。人CRT基因定位于p13.2-p13.3，具有调节钙平衡、协助蛋白质的折叠和加工、参与抗原提呈、血管发生、胚胎发育及凋亡的调节等多种生物学功能[7]。近年来研究表明，CRT在多种肿瘤中特异性表达增加，与肿瘤的发生发展、诊断、预后判断以及治疗密切相关[8]。ALFONSO等[9]采用蛋白质组学技术发现结肠癌差异蛋白质中有CRT，可能是潜在的标志。CHEN等[10]显示，CRT在胃癌中高表达，可促进胃癌细胞增殖与迁移，上调胎盘生长因子PlGF与VEGF表达和分泌，与高微血管密度、浆膜侵袭、淋巴结转移、神经周的侵袭、临床分期以及预后不良有关，CRT可能是独立的预后标志。YOON等[11]证实，肝细胞癌、宫颈癌HeLa细胞、膀胱癌EJ细胞等肿瘤细胞的核基质中存在大量CRT，而非癌组织没有，表明CRT在恶性转化时能够易位核内，提示CRT核内易位表现出其确实具有调节的生物功能。MANS等[12]研究表明，FAB分类的所有急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)亚型患者白血病细胞中CRT表达明显上调。可见，CRT与白血病的发生发展密切相关。

本研究结果显示，1.25 mg/L DADS处理HL-60细胞24、48和72 h后，CRT mRNA相对表达率和CRT的蛋白表达水平均明显下降，这些结果提示DADS抑制HL-60细胞增殖可能与下调CRT有关。为进一步探明CRT在DADS抑制HL-60细胞增殖中的作用，本研究采用SiRNA干扰技术沉默HL-60细胞CRT基因表达。结果显示，沉默CRT 48 h后，CRT mRNA表达和蛋白表达较对照组均显著下调，与DADS呈现协同效应，这些结果表明DADS与沉默CRT均可下调CRT表达。MTT检测显示，CRT干扰组细胞的增殖能力与对照组相比明显降低，DADS与沉默CRT均可抑制HL-60细胞增殖，而沉默CRT可增强DADS的作用。这些结果表明CRT可能是DADS抗白血病细胞的作用靶点。

总之，本研究结果显示DADS能抑制人白血病细胞增殖，其机制可能与下调CRT的表达有关，表明CRT可能是DADS抑制人白血病细胞增殖的关键分子，这对阐明DADS抗白血病的机制具有重要意义。

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