内蒙古奇乾地区媒介蜱携带伯氏疏螺旋体的调查研究

汤 芳，周 磊，蒋兰芬， 栾 进，浮飞翔

莱姆病（Lyme disease, LD）是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferii, B.b）侵犯机体而引起的全身性多系统疾病，该病是经媒介蜱传播的一种自然疫源性疾病。LD分布相当广泛，我国自1986年首次在黑龙江省海林县林区发现该病以来，大小兴安岭、天山、长白山、燕山、阿尔泰山等林区均存在人群感染[1]。内蒙古奇乾地区地处中俄界河额尔古纳河畔，大兴安岭北部原始森林腹地，北纬 52°11′45.30″ ，东经120°46′21.42″，为高寒山林和寒温带大陆性气候，年平均气温-6 ℃，年平均降雨量436.5 mm。该地区自然资源丰富，媒介物种多样，生态环境适宜LD的发生流行。为进一步了解奇乾地区媒介蜱中B.b感染及基因分型情况，本研究对该地区进行了选点调查研究。

1 材料与方法

1.1 标本采集 在媒介蜱活动高峰期（4—6月），根据奇乾地区自然地理和生态环境的特点，选择有代表性的生境（山地森林景观和灌丛草地景观）作为调查点，用布旗法采集游离蜱，媒介蜱经分类鉴定后使其保持存活状态，待送往实验室进行病原学的检测。

1.2 实验室检测

1.2.1 标本处理及模板制备 将采集到的媒介蜱标本放入用75%乙醇浸泡10 min，高压灭菌滤纸吸干媒介蜱体表乙醇，0.9%氯化钠溶液漂洗3次后，将单只媒介蜱置于1.5 ml离心管中，加入DNA提取缓冲液50 μl，用组织研磨器将蜱捣碎、研磨，沸水中煮10 min，置-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 根据文献设计特异性引物[2-3]，用PE9700 PCR扩增仪（美国ABI公司）进行PCR 扩增。PCR 反应体系由 10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP MIX 2 μl，Taq 酶 0.3 μl，上下引物各 l μl组成，充分混匀后加入DNA模板1 μl；扩增条件 94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s ，41 ℃ 30 s，72 ℃1 min→72 ℃10 min，扩增36个循环。取PCR产物5 μl，用1.2% 的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像分析系统（法国Vilber Lourmat公司）观察结果。每次实验都设立空白（水）对照，并采取严格措施以避免污染。

1.3 DNA同源性比较和聚类分析 PCR扩增产物送北京天一辉远生物公司测序，通过Internet进入美国国家生物技术信息中心（www.ncbi.nlm.nih.gov）站点后，把测序所获得序列与GenBank中已注册的基因序列进行BLAST比对。

1.4 统计学处理 数据录入、分析采用SPSS 13.0软件，计算相应频数和阳性率。

2 结 果

2.1 媒介蜱采集情况 共采集游离蜱320只，其中全沟硬蜱293只（91.56%），嗜群血蜱5只（1.56%），森林革蜱22只（6.88%）。

2.2 媒介蜱感染情况 奇乾地区媒介蜱B.b感染阳性携带86只，阳性率为26.88%。其中全沟硬蜱B.b阳性携带率为29.01%（85/293）；森林革蜱B.b阳性携带率4.55%（1/22）；嗜群血蜱未检测出B.b（详见表1）。媒介蜱携带B.b有3种基因型：B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoi，其中B.garinii阳性携带率为18.13%（58/320），B.afzelii阳性携带率为6.25%（20/320），B.miyamotoi阳性携带率为2.50%（8/320）。

表1 奇乾地区媒介蜱B.b感染情况[例（%）]Table 1 Prevalence of B.b in ticks among Qiqian region[cases(%)]

2.3 序列分析 将PCR阳性产物进行测序、序列比对和聚类分析发现，B.b阳性序列为B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoi基因型。

3 讨 论

本研究共采集媒介蜱320只，其中全沟硬蜱293只（91.56%），嗜群血蜱5只（1.56%），森林革蜱22只（6.88%），表明内蒙古奇乾地区媒介蜱以全沟硬蜱为优势蜱种。媒介蜱B.b阳性携带率为26.88%，其中全沟硬蜱B.b阳性携带率为29.01%，森林革蜱B.b阳性携带率4.55%，嗜群血蜱均未检测出B.b，提示全沟硬蜱是该地区LD的主要传播媒介。媒介蜱携带B.b有3种基因型：B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoii，结果提示该地区B.b基因型存在多样性的特点。其中B.garinii阳性携带率最高，为18.13%（58/320），B.afzelii、B.miyamotoi阳性携带率分别为6.25%（20/320）和2.50%（8/320）。B.garinii是B.b最常见的基因型别，许多国家、地区的宿主动物和媒介蜱体内都可以检测到该基因型的存在[4-12]。研究发现内蒙古大兴安岭林区媒介蜱及鼠体内存在B.b的感染，以全沟硬蜱的感染率最高，以B.garinii为主要基因型[13]。B.afzelii是B.b第二种常见的基因型别，分布范围和B.garinii类似，在啮齿动物和媒介蜱中也有类似的分布[14]。B.miyamotoi属于疏螺旋体属中的回归热螺旋体，但生物学上与B.b中的B.garinii、B.afzelii和B.burgdorferi等更为接近。主要寄生在硬蜱体内，常与B.garinii、B.afzelii等基因型混合感染，目前尚未发现有B.miyamotoi单独感染的报道[15-16]。

内蒙古地区是我国蜱媒传染病的重要疫区之一，在宿主动物和媒介蜱中发现携带有包括B.b、斑点热群立克次体、嗜吞噬细胞无形体、查菲埃立克体、森林脑炎病毒等多种病原体感染。奇乾地区自然景观复杂多样、生态物种丰富，为LD自然疫源地的形成和持续存在提供了必要条件。因此，下一步研究我们还须要从传播媒介、宿主动物和易感人群3个流行环节开展自然疫源地流行病学调查，确定自然疫源地性质与特征，掌握疫源地演变规律，获得系统的流行病学本底资料。

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