海南裸花紫珠药材中7种成分含量分析△

谭湘杰，于福来，庞玉新，黄梅，陈振夏，杨全，李伟

（1.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；

2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737；3.海南九芝堂药业有限公司，海南 海口 570311）

裸花紫珠药材为马鞭草科植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.的干燥叶和带叶的嫩枝，收载于《中华人民共和国药典》1977年版，为海南省道地药材。主产于我国海南，广东、广西也有分布。国外主要分布于印度、越南和马来西亚。裸花紫珠具有止血散瘀、消炎抗菌之功效［1］。以抗炎、止血为功效制成的裸花紫珠片、裸花紫珠栓等中成药广泛应用于临床［2］。

裸花紫珠野生变家种不过十年，随着近几年药材收购量增加，海南各地也开展了裸花紫珠种植探索，但不同产地、不同批次裸花紫珠药材化学成分不稳定。前期系列研究表明［3-8］，不同来源的裸花紫珠药材成分含量差异较大，但关于不同产地和气候区下裸花紫珠药材品质的比较分析报道较少。课题组前期对海南不同来源29份裸花紫珠的木犀草苷和毛蕊花糖苷含量变化进行探索［6］，受材料来源数量限制，无法找出产地和气候区下的变化规律。为此，本研究继续收集了海南省9市（县）75份裸花紫珠药材，对涉及药材品质的7种不同成分含量进行测定，分析不同产地气候条件下裸花紫珠药材化学成分差异及变化规律，以期为裸花紫珠优质药材生产区划提供依据。

1 材料

1.1 仪器与试药

仪器为安捷伦1260系统（G1311C四元泵，G1316A柱温箱，G1329B全自动进样器；G1315D二极管阵列检测器）；Agilent Chem Station工作站；色谱柱为 Aglient TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；Sartarius CPA225D电子分析天平；KQ-500DB型超声仪。

对照品：咖啡酸（批号：Y17D6C7672）、连翘酯苷 B（批 号：20140120）、木 犀 草 苷 （批 号：Y23S7H21785）、毛蕊花糖苷（批号：PMO321SA14）、异毛蕊花糖苷（批号：HA0820KA29）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号：P20N6F6297）（以下简称芹菜素糖苷）、木犀草素（批号：YO1D6S6815）均采购于上海源叶生物制药公司，纯度均在98%以上。水为Merck Millipore纯水机制备的超纯水（MingcheD24UV），乙腈为色谱纯（安徽天地高纯溶剂有限公司），其余试剂均为分析纯。

1.2 药材样品

裸花紫珠药材样品于2016年5—8月采自海南省9市（县），共计75份。经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新研究员鉴定为裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn。参考车秀芬等的海南省气候区划结果［9］，将不同来源样品归为两个气候区，所有样品信息见表1。

表1 海南裸花紫珠样品信息表

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent-TC C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脱（0～30 min，8%～16%A；30～45 min，16%～21%A；45～55 min，21% ～24%A；55～65 min，24%～35%；65～70 min，35% ～100%）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：330 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取适量咖啡酸、木犀草素对照品，置于不同的10 mL容量瓶中，加入70%甲醇水溶解定容。分别精密称取适量连翘酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷对照品，置于同一10 mL容量瓶中，加入适量70%甲醇水溶解后再加入上述咖啡酸和木犀草素对照品溶液各1 mL定容。即配制成含咖啡酸0.001 64 mg·mL-1、连翘酯苷 B 0.225 mg·mL-1、木犀草苷0.062 mg·mL-1、毛蕊花糖苷2.01 mg·mL-1、异毛蕊花糖苷 0.251 mg·mL-1、芹菜素糖苷0.155 mg·mL-1、木犀草素 0.001 95 mg·mL-1的对照品母液。对照品谱图见图1。

图1 裸花紫珠样品及混合对照品HPLC图

2.2.2 供试品溶液的制备 称取1 g裸花紫珠粉末置于100 mL离心管中，加入70%甲醇水50 mL，超声提取20 min后（功率100%），吸取上层清液使用0.22μm的微孔滤膜过滤即得。供试品溶液谱图见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察 取2.2.1条件下母液，分别稀释1、2.5、5、10、50、100倍，制成相应浓度梯度对照品溶液。在安捷伦1260系统下进样分析，并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到相应的回归方程，见表2。

表2 咖啡酸等7种成分的标准曲线及线性范围

2.3.2 精密度考察 吸取2.2.1条件下对照品母液，在液相色谱系统下平行进样6次，结果咖啡酸、连翘酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面积RSD值分别为0.52%、 0.73%、 0.64%、 2.7%、 0.57%、0.62%，保留时间 RSD值分别为 0.116%、0.090%、0.068%、0.071%、0.074%、0.058%、0.023%，表明该仪器精密性良好。

2.3.3 重复性考察 平行称取裸花紫珠样品粉末6份，每份1 g，置于6个100 mL离心管中。在6个离心管中分别加入70%甲醇水50 mL，超声提取20 min后，使用0.22μm微孔滤膜进行过滤，作为样品待测。在液相系统下进样后，结果咖啡酸、连翘酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面积RSD值分别为1.61%、1.46%、1.78%、1.77%、2.45%、2.23%、2.11%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 称取裸花紫珠样品1 g，置于100 mL离心管中，加入70%甲醇水50 mL，超声20 min后，经0.22μm的微孔滤膜过滤后，分别放置0、2、4、8、12、24 h后使用液相系统测量该供试品溶液。结果咖啡酸、连翘酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面积 RSD值分别为 2.00%、1.96%、1.43%、2.02%、1.78%、1.56%、2.25%，表明常温下，供试品溶液在24 h内各成分稳定。

2.3.5 回收率考察 平行称取已知含量的裸花紫珠粉末6份，每份0.5 g，置于100 mL离心管中，加入50 mL配置标准品溶液（各成分含量与裸花紫珠粉末中成分含量相等）。超声20 min后，经0.22μm的微孔滤膜过滤后待测。结果咖啡酸、连翘酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各成分平均回收率为95.9%（RSD＝1.72%）、96.0% （RSD＝2.38%）、104.0% （RSD ＝2.85%）、105.6% （RSD＝0.98%）、97.8% （RSD ＝2.10%）、98.8%（RSD＝2.50%）、96.5%（RSD＝3.00%）。

3 结果与分析

3.1 裸花紫珠药材7种成分统计量分析

75份裸花紫珠药材7种成分含量基本统计量见表3。所有7种成分平均含量范围在0.168～19.128 mg·g-1，其中毛蕊花糖苷含量最高，异毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、木犀草苷次之，芹菜素糖苷、木犀草素、咖啡酸含量较低；除木犀草素外，其他6种成分变异系数均在50%以上，其中连翘酯苷B达到83.91%。这说明不同来源裸花紫珠药材主要化学成分存在较大的差异。

表3 裸花紫珠药材中7种成分含量基本统计量（n＝75）mg·g-1

3.2 不同产地和气候区裸花紫珠药材7种成分含量比较

从表4可以看出，不同产地间裸花紫珠药材7种成分均存在不同程度的差异。其中五指山和白沙两地的毛蕊花糖苷含量最高，与海口的样品具有统计学差异（P＜0.05），7种成分含量总和与毛蕊花糖苷变化规律相似；除五指山和白沙外，东方样品也与其他产地具有统计学差异（P＜0.05）。在木犀草苷含量方面，琼中、五指山、东方与定安、海口、临高具有统计学差异（P＜0.05）。在连翘酯苷B含量上，五指山、乐东与定安、海口具有统计学差异（P＜0.05）。在异毛蕊花糖苷含量上，东方与定安、海口、临高具有统计学差异（P＜0.05）。咖啡酸与木犀草苷类似，五指山、乐东、东方与定安、海口、临高具有统计学差异（P＜0.05）。在芹菜素糖苷含量上，琼中、乐东与定安、海口、临高具有统计学差异（P＜0.05）。在木犀草素含量上，琼中、五指山、乐东与海口、定安具有统计学差异（P＜0.05）。

表4 海南不同产地裸花紫珠主要化学成分含量方差分析mg·g-1

从以上分析可看出，整体含量上差异可较明显分为两大类，以五指山、白沙为代表的海南中南部和以海口、临高为代表的海南北部。这种划区恰好与车秀芬等对海南岛气候区划结果相似，即定安、屯昌、海口和临高划为北部边缘热带湿润区（ⅠATa），白沙、琼中、五指山以及乐东、东方部分地区划为中部山地边缘热带湿润区（ⅠATb）。进一步对两个区域7种成分含量比较，发现均存在统计学差异（P＜0.05）。

3.3 不同产地和气候区裸花紫珠药材7种成分含量主成分分析

为了更清晰地看出成分含量不同气候区间的差异，本研究采用主成分分析，将7种化学成分提取了两类主成分，共解释了81.10%的总方差。从图2A上可看到两个气候区的样品基本上聚成两大类，而9个不同产地间样品很难区分开（见图2B），同时不同产地内部也存在一定的变化。这说明本研究仅从产地上不能很好解释裸花紫珠药材成分内在变化规律。

图2 不同气候区和不同产地裸花紫珠化学成分主成分图

4 讨论

4.1 裸花紫珠药材质量控制指标的选择

以往关于裸花紫珠药材质控指标通常选择毛蕊花糖苷和黄酮类其中一到多个成分或指纹图谱［4-8］作为裸花紫珠药材质量控制依据，在成分上同属类药材［10-13］也常以这些成分作为质量控制指标。虽然对其药材质量控制具有指导意义，但在指标选取上仍缺乏系统性。本研究借鉴刘昌孝等［14］提出的中药质量标志物（Q-marker）概念，在系统分析裸花紫珠近200种成分基础上，筛选被定量过的、具有抗炎、止血的成分以及种属特异性的成分作为质控指标，共筛选了7种主要成分，包括3种黄酮（木犀草苷、木犀草素、芹菜素糖苷）、3种酚苷（连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷）、1种酚酸（咖啡酸）。并建立了同时测定7种成分的HPLC方法，该方法简便可行，重复性好，可用于裸花紫珠的质量控制。

4.2 裸花紫珠药材成分含量差异及影响因素探讨

关于裸花紫珠化学成分定性定量分析报道较多［3-8］，但有关不同产地、不同气候区裸花紫珠主要成分变化规律的研究不足。课题组前期对海南产的29份裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量进行过分析，发现不同产地间两种成分变化较大［6］。本研究继续扩大样本量，选取海南裸花紫珠主要分布区，发现裸花紫珠药材化学成分在不同气候区具有显著的差异，说明环境因子对裸花紫珠药材化学成分具有较大的影响。但这种差异具体到产地上就得到弱化。分析原因，一方面部分产地在环境因子上比较相似，使得总体上产地间这种差异不大。另一方面可能产地内部样品的差异过大导致产地间的差异不显著。因在样品收集过程中发现，部分产地（如定安县的龙河镇和翰林镇）即便是同一市（县）不同乡镇之间，土壤差异都很大，同时这些样品株龄也不尽相同，致使同一乡镇某些样品内部化学成分含量出现较大波动。因此，今后应继续对不同样品对应的土壤进行分析，寻找影响这些样品化学成分差异可能的土壤因子，以期为优质裸花紫珠药材生产的区划提供依据。

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