高效液相色谱法同时测定桑龙平喘合剂中芦丁和绿原酸的含量*

董军何燕飞孙红祥

1 浙江省绍兴市中医院 浙江 绍兴 312000

2 浙江大学 浙江 杭州 310058

桑龙平喘合剂系由桑白皮、地龙、炙麻黄、杏仁、炒苏子、葶苈子、炙冬花、射干、鱼腥草、金荞麦、全蝎、当归和甘草组成。本研究应用高效液相色谱法（HPLC）建立同时测定桑龙平喘合剂中芦丁和绿原酸含量的方法，为其质量控制提供科学依据。

1 仪器与试剂

Waters 600高效液相色谱仪，Waters 2996 PDA检测器，Empower色谱工作站（美国Waters公司）；色谱柱为Diamond C18键合硅胶柱（5mm×250mm，5μm）；Sartorious型电子分析天平（德国W-Germany）；超纯水仪（德国曼默博尔公司）。甲醇（分析纯），乙腈（色谱纯），磷酸（分析纯），均购自国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水，使用前以微孔滤膜过滤。绿原酸对照品（110753-201415，含量98%）和芦丁（100080-201610，含量测定用）均购自中国食品药品检定研究院。桑白皮（140901）、地龙（150406）、炙麻黄（150302）、杏仁（150312）、炒苏子（150115）、葶苈子（150208）、炙冬花（150301）、射干（141213）、鱼腥草（150327）、金荞麦（150308）、全蝎（150126）、当归（150213）和甘草（140917）由绍兴市中医院提供，经绍兴市食品药品检验中心专家鉴定符合2015年版《中华人民共和国药典》（简称《药典》）标准。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱：Diamond C18（5mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；梯度洗脱0～5min5%A，5～10min12%A，10～25min15%A，25～45min 28%A，45～50min 100%A，50～50min 5%A；检测波长：324nm（绿原酸）和254nm（芦丁）；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；柱温：35℃。

2.2 对照品溶液制备：精密称取绿原酸对照品16.2mg和芦丁对照品15.0mg，置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液（绿原酸和芦丁的浓度分别为1.62和1.50mg/ml）。分别精密量取绿原酸和芦丁储备液各2.5ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液及阴性对照溶液制备：按处方分别称取药材（合计110g），分别以10倍和8倍量水煎煮1.5h和1.0h。煎煮液纱布滤过，滤液减压浓缩至110ml，加入2倍量的95%乙醇，静置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇浓缩至55ml，得桑龙平喘汤合剂，生药浓度为2.0g/ml。取3个批次桑龙平喘汤合剂各1份，每份2.0ml，分别置于10.0ml容量瓶，甲醇稀释并定容至刻度，以0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。缺绿原酸阴性对照组方药为金荞麦、地龙、炒苏子、葶苈子、炙麻黄、射干、杏仁、生甘草、全蝎；缺芦丁阴性对照组方药为地龙、炒苏子、葶苈子、炙麻黄、射干、杏仁、全蝎，阴性对照溶液制备方法与供试品溶液相同。

2.4 系统适用性试验：分别精密吸取桑龙平喘汤供试品溶液、绿原酸对照品溶液、芦丁对照品溶液、混合对照品溶液、缺绿原酸阴性对照溶液和缺芦丁阴性对照溶液各10μl，按“2.1”项色谱条件分别测定。绿原酸和芦丁的理论塔板数分别为7108和3467，两者均大于3000，即绿原酸和芦丁均达到基线分离。阴性对照溶液在与对照品相对应的色谱峰位处无干扰峰出现。结果见图1。

2.5 线性关系考察：分别精密量取混合对照品溶液1.0、3.0、5.0、10.0、20.0ml于25.0ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。按“2.1”项色谱条件分别精密吸取10μl进样测定，记录色谱峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，以对照品溶液浓度（X）为横坐标作线性回归，得绿原酸和芦丁峰面积标准曲线，所得回归方程见表1。结果表明绿原酸、芦丁在线性范围内线性关系良好。绿原酸浓度25.3μg/ml时S/N值为43.7，芦丁浓度23.4μg/ml时S/N值为61.8，均大于10，满足定量要求。

2.6 稳定性试验：精密吸取“2.3”项的供试品溶液10μl，分别于0、4、6、8、12和24h测定，绿原酸和芦丁峰面积RSD值分别为1.85和1.43，说明供试品溶液在24h内稳定。

图1 桑龙平喘汤高效液相色谱图

表1 绿原酸和芦丁的回归曲线

2.7 仪器精密度试验：精密吸取“2.2”项混合对照品溶液10μl，按“2.1”项色谱条件，重复进样6次，峰面积积分值基本一致，绿原酸和芦丁峰面积RSD值分别为0.57%和0.69%。

2.8 重复性试验：分别取同一批次桑龙平喘汤合剂，按“2.3”项方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件进样测定，以峰面积计，RSD分别为1.79和1.28，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验：精密吸取已测得含量的桑龙平喘汤合剂样品9份，每份0.2ml，置于1.0ml量瓶中，分别加入绿原酸对照品溶液（810.0μg/ml）和芦丁对照品溶液（375.0μg/ml）各50、100、150μl，以甲醇稀释并定容至刻度。按“2.3”项方法制备样品溶液，并按“2.1”项色谱条件分别测定，计算回收率。见表2。

2.10 样品含量测定：取3批桑龙平喘合剂样品，按“2.3”项方法制备样品，精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述含量测定方法测定，计算样品中绿原酸和芦丁含量。见表3。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

表3 含量测定结果（n=3）

3 讨论

根据2015年版《药典》，绿原酸和芦丁的含量可在340nm处同时测定。然而，本实验分别提取绿原酸和芦丁在340nm波长和最大吸收波长的峰面积进行线性回归，发现在340nm处提取的色谱图峰面积的相关系数比最大吸收波长处小，尤其是芦丁的线性关系较差。因此，采用二极管阵列检测器（DAD）程序可变波长法，使绿原酸和芦丁分别在各自的最大吸收波长处进行检测。因桑龙平喘汤成分复杂，各成分之间极性差别较大，采用等度洗脱无法实现各个色谱峰较好的分离。故本实验采用线性梯度洗脱的方法。通过考察乙腈-水梯度变化对出峰的影响，以及不同浓度磷酸水溶液对峰型、分离度的影响，最终确定乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～5min5%A，5～10min12%A，10～25min15%A，25～45min 28%A，45～50min 100%A，50～50min 5%A）。此时，绿原酸、芦丁能与其他组分达到基线分离，峰型对称。本实验所建立的HPLC法能对桑龙平喘汤中绿原酸和芦丁进行同时测定，可用于桑龙平喘汤的质量控制。