罗丹明基类分子荧光探针在丙酮酸细胞内可视化成像中的应用

王 硕，孙晓艳，陈金龙*

(1中国药科大学药学院药物分析系，南京 210009；2中国药科大学药物质量与安全预警教育部 重点实验室，南京 210009；3江苏省中医药研究院分子与细胞生物实验室,南京 210028)

近年来，研究人员基于代表性有机染料，如罗丹明、香豆素、荧光素，设计出许多荧光传感器[1-3]，其中罗丹明是一类性能优良的分子荧光染料，具有高荧光量子效率[4-6]。医学工作者将这些传感器用于检测细胞内、外生物分子[7-9]，通过检测这些标志物的含量来诊断某些疾病，其中维生素B1缺乏症可通过检测血液丙酮酸(pyruvic acid，PA)来诊断。硫胺素焦磷酸是维生素B1的主要辅酶形式，在细胞内参与PA进一步氧化分解为乙酰辅酶A。维生素B1缺乏时，体内PA的氧化过程受阻，使PA的含量增加，其主要临床表现为自主神经功能紊乱、心力衰竭、共济失调、双下肢周围性瘫痪等[10]。因此，建立一种对该类疾病的检测方法尤为重要。

丙酮酸是连接糖酵解和三羧酸循环的一种重要的有机α-酮酸，维持体内糖、脂肪、氨基酸之间的平衡。α-酮酸与氨基酸之间的转氨作用可在温和生理条件下进行，其中关键步骤氨基酸的氨基与辅酶磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)发生席夫碱反应，生成亚胺结构[11](图1)，说明活性羰基易与氨基基团发生高效反应和转化。目前检测PA的方法主要有荧光法[12]、比色法[13]、化学发光法[14]、高效液相色谱法[15]、气相色谱法[16]等。化学发光法、色谱法需要复杂的样品处理过程，且检测成本昂贵使其无法得到广泛应用。而PA由于自身化学结构特点，吸收波长短，且消光系数小，羰基显色试剂——二硝基苯肼对PA比色法检测存在专属性差和灵敏度低的不足[17-18]。与这些方法相比，荧光法具有操作简单、检测快速、专属性高等优点。

Figure1 Schiff base reaction occurred between the amino acid and pyridoxal phosphate (PLP)

针对传统检测方法的不足，本文设计3种罗丹明类酰肼探针：RhB-NH2、R6G-NH2、R-101-NH2、(图2)。探针本身无荧光，分子结构中酰肼基团的N原子有孤对电子，易与PA结构中的羰基发生缩合反应，生成席夫碱，所生成的席夫碱共轭体系扩大，诱导吡咯环开环，实现探针荧光信号增强，从而建立一种水相检测PA的新方法(图3)。体内常见生物分子、阴阳离子以及活性氧化物等几乎无干扰，探针分子对PA具有高专属性，成功应用于A549、293T活细胞中丙酮酸的荧光成像。

Figure2 Molecular structures of R6G-NH2,R-101-NH2and RhB-NH2

Figure3 Proposed mechanism for the reaction of probe model with pyruvic acid (PA)

1 材 料

1.1 试 剂

丙酮酸、罗丹明B、水合肼(阿拉丁试剂有限公司)；罗丹明6G(美国Acros Organics公司)；罗丹明101(美国Sigma-Aldrich试剂有限公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)、青霉素、链霉素(美国Invitrogen公司)。其他试剂均为市售分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪 器

F-4600荧光光谱仪(日本日立公司)；UV-1700紫外分光光度计(日本岛津公司)；三重四极杆质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)；Axio Observer A1蔡司倒置荧光显微镜(德国卡尔蔡司公司)。

1.3 细胞系

人非小细胞肺癌细胞细胞系A549、肾上皮细胞系293T(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

2 方 法

2.1 罗丹明基荧光探针的合成

依据文献[19-20]，分别称取一定量罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明101溶解于甲醇中配制成100 mmol/L溶液，加入过量水合肼，氮气保护下水浴加热至75 ℃回流搅拌反应4 h至颜色褪去。将反应混合物倒入去离子水中，用乙酸乙酯萃取(25 mL×3)至水层无色，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得到罗丹明6G酰肼(R6G-NH2，淡黄色固体，产率74.2%)、罗丹明101酰肼(R-101-NH2，粉红色粉末，产率75.8%)和罗丹明B酰肼(RhB-NH2，浅粉色粉末，70.8%)。

2.2 探针储备液的配制

分别准确称取一定量的R6G-NH2、R-101-NH2、RhB-NH2，用乙醇完全溶解，配制成1 mmol/L探针储备液。

2.3 丙酮酸储备液的配制

用二次蒸馏水稀释PA原液，配成不同浓度的PA溶液。

2.4 荧光探针对各种分析物的光学响应

在10 mL具塞刻度试管中，移液管移取乙醇1.00 mL,HEPES-NaOH缓冲液(200 mmol/L，pH 5.40)1.00 mL，适量探针储备液，摇匀，加入一定浓度各分析物，用二次蒸馏水稀释，定容至刻度，摇匀，37 ℃静置，避光反应10 min后进行荧光、紫外吸收测试。

2.5 组织液中丙酮酸检测

称取植物样品5.0 g于研钵中加入少许石英砂，研磨成匀浆，用无水乙醇(5 mL)浸洗4次，转入25 mL量瓶，定容至刻度，室温避光静置30 min，取匀浆液10 mL离心(4 000 r/min)10 min，取上清液备用。在10 mL具塞刻度试管中，移液管移取上清液1.00 mL,HEPES-NaOH缓冲液(200 mmol/L，pH 5.40)1.00 mL，探针储备液(1 mmol/L)70 μL，摇匀，二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，37 ℃静置，避光反应10 min后进行荧光测试。

2.6 细胞外源性丙酮酸荧光成像

细胞系A549、293T是用F12K培养基(DMEM)进行培养，其中添加10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)。取对数生长期细胞，以每毫升1.5×105个细胞的密度接种在直径为35 mm的细胞培养皿中，培养过夜后，把培养液换成含有10 μmol/L R6G-NH2的培养基，细胞在37 ℃下继续孵育30 min。然后把部分培养液换成添加有50、100 μmol/L PA的培养基，继续孵育30 min。用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)洗涤3次后，细胞放在荧光显微镜(200倍物镜，激发波长488 nm)，进行观察、拍摄。

2.7 细胞内源丙酮酸荧光成像

取细胞系293T对数生长期细胞，以每毫升1.5×105个细胞的密度接种在直径为35 mm的细胞培养皿中，培养过夜后，把部分培养液换成含有1 nmol/L双酚A(BPA)的培养基，细胞在37 ℃下继续孵育24 h。然后把部分培养液换成添加有10 μmol/L R6G-NH2的培养基，继续孵育30 min。用PBS(0.01 mmol/L，pH 7.4)洗涤3次后，细胞置荧光显微镜下进行观察及拍摄。

3 结果与讨论

3.1 探针筛选与检测机制

为研究探针分子结构对PA识别能力的影响，通过比较5 μmol/L 3种探针在各自最大发射处的相对荧光强度(F/F0-1)对PA浓度(50，120 μmol/L)响应结果，评价各探针分析性能(图4)，探针R6G-NH2对PA各浓度响应最好，因此，选择R6G-NH2为目的探针深入研究。为验证上述推测，采用荧光分光光度法、紫外分光光度法和质谱法对反应机制进行初步探究。

Figure4 Fluorescence responses of the three probes (5 μmol/L) to the different concentration of PA

如图5所示，激发波长为510 nm，探针本身在565 nm处荧光强度较低，且在450～650 nm之间几乎没有紫外吸收，这是因为探针处于螺环状态，芳香环之间没有形成有效共轭结构[21]，与PA发生反应后，探针在565 nm处荧光强度显著增强，在533 nm处出现特征吸收峰，溶液由无色变为粉红色，说明探针与PA作用后，吡咯环开环导致荧光和颜色的变化。质谱结果表明，探针本身分子离子峰[M+H]+出现在429.24(理论值429.22)，加入PA后，探针峰消失，在499.25处出现新的离子峰，这与探针和PA反应生成产物的理论值499.23吻合。

Figure5 Effect of R6G-NH2on PA

A:Fluorescence spectra of R6G-NH2before and after reaction with PA,Inset:photographs under UV light (365 nm);B:UV-Vis spectra of R6G-NH2before and after reaction with PA,Inset:photographs under sunlight;C:ESI-MS results of free R6G-NH2;D:ESI-MS results of the corresponding product of R6G-NH2and PA

3.2 检测条件的优化

从有机助溶剂的种类及比例、探针浓度、pH以及反应温度等方面优化检测条件。由于探针R6G-NH2难溶于水而易溶于有机溶剂，为了实现均相分析的目的，需要加入适量与水互溶有机溶剂。分别以体积比为10%的4种常见溶剂甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)为基底，测试加入PA(20、100 μmol/L)前后溶液的荧光强度，比较不同有机相存在条件下，荧光强度增强变化量F/F0-1(图6-A)。结果表明，在体系中加入乙醇检测灵敏度最高，且PA在乙醇-水(1∶9)的体系中对R6G-NH2探针荧光恢复最强(图6-B)，因此，选择乙醇作为检测体系的助溶剂。对R6G-NH2探针浓度优化(图6-C)，结果发现7 μmol/L探针荧光恢复效果最好，因此最终选择7 μmol/L探针浓度作为分析浓度。

酮类化合物与肼反应一般是在酸催化下进行，羰基氧与质子结合，可以提高羰基的活性，但若酸性过强，肼与质子结合形成盐，会丧失它们的亲和性[22]，因此，探针以及产物分子中吡咯环结构的开闭与pH紧密相关。为了优化检测pH，本研究考察了不同pH体系下探针荧光强度恢复能力。如图7-A所示，向探针溶液中分别加入20、100 μmol/L PA，在酸性较强的条件(pH<5.3)下，由于强质子化环境使探针自发开环，出现较强的荧光背景，pH>5.3时，探针在相对较弱的质子化环境中无显著的荧光信号，且当pH=5.4时，体系的荧光增强倍数达到最大。

反应温度也是影响反应速率的重要因素之一，本研究进行一系列平行实验以探究温度对反应结果的影响。通过测试5～70 ℃范围内探针与PA反应前后荧光变化趋势，如图7-B所示，结果表明R6G-NH2与PA反应产物的荧光强度随温度变化并不明显，因此选择一般正常人的体温37 ℃作为检测条件，有利于实现探针的实际应用。

Figure6 Effects of reaction conditions on response of R6G-NH2to PA

A:Organic phase (R6G-NH2:5 μmol/L);B:Ethanol content (R6G-NH2:5 μmol/L);C:R6G-NH2concentration

Figure7 Effects of reaction conditions on response of R6G-NH2to PA

A:pH;B:Temperature (R6G-NH2:5 μmol/L)

3.3 探针R6G-NH2分析性能

经优化得到最佳检测条件：7 μmol/L探针R6G-NH2加入到20 mmol/L pH 5.40 HEPES-NaOH缓冲液中，体系中乙醇-水(1∶9)，反应温度37 ℃，然后分别加入不同浓度PA溶液。在此条件下，探针R6G-NH2与不同浓度PA反应后荧光光谱曲线如图8-A所示。随PA浓度增大(0～160 μmol/L)，探针在565 nm处荧光强度逐渐增强，当PA浓度达120 μmol/L时，探针荧光强度基本保持稳定，呈现出较强的黄色荧光。结果发现，如图8-B所示，探针R6G-NH2在565 nm处荧光强度变化量(F/F0-1)与PA浓度(0.2～120 μmol/L)呈良好线性相关，线性方程为：F/F0-1=0.013 4c(PA)+0.012 5(R2=0.998 7)，式中F和F0分别是探针R6G-NH2与PA作用后、以及探针自身的荧光强度，检测下限低至0.1 μmol/L。荧光探针R6G-NH2与不同浓度PA紫外吸收光谱如图8-C所示，探针溶液在450～650 nm之间几乎无紫外吸收，加入PA后，533 nm处出现新的明显吸收峰，溶液颜色逐渐由无色变为红色，这是因为生成物Schiff碱引起吡咯环开环，共轭结构增大。因此，探针R6G-NH2是一种潜在具有比色/荧光双通道识别PA分子的传感器。

3.4 探针选择性考察

Figure8 Analysis performance of R6G-NH2

A:Fluorescence spectra of R6G-NH2with different concentrations of PA (0-160 μmol/L),Inset:images under UV light (365 nm);B:Linear calibration plot of the various concentrations of PA between the enhancement of fluorescence intensity;C:UV-Vis spectra of R6G-NH2with different concentrations of PA (0-1.5 mmol/L),Inset:images under sunlight;D:Linear calibration plot of the various concentrations of PA between the enhancement of absorbance intensity

Figure9 Selective response of R6G-NH2to pyruvic acid affected by conventional biomolecules and ionic species

A:Fluorescence response of R6G-NH2(7 μmol/L) to different amino acids (500 μmol/L) and PA (100 μmol/L);B:Fluorescence response of R6G-NH2(7 μmol/L) to protein,various anions,ROS and dicarbonyl derivatives (Cu2+,Fe3+:30 μmol/L;BSA,HGB,DNA:50 μg/mL;and other interfering substances concentrations of 500 μmol/L).Inset:images of R6G-NH2and with different amino acids,anions and PA solutions in sunlight (a) and UV light (365 nm,b)

3.5 组织液中丙酮酸的检测

为了验证R6G-NH2纳米探针的可行性，本研究选取洋葱、大蒜、大葱3种植物样品。样品研磨成匀浆溶于乙醇,去除蛋白，经4 000 r/min转速离心，取上清液，用探针与2,4-二硝基苯肼检测各组织液中丙酮酸含量。如图10所示，3种组织液样品中PA含量的两种方法检测结果均高度吻合。说明基于分子荧光探针的分析方法，快速灵敏，准确且不需要繁琐复杂的样品处理过程，操作简单易行。

3.6 细胞成像

PA是糖酵解的主要产物，而糖酵解主要在细胞质中进行，因此细胞中含有丰富的PA[23]。为了探讨R6G-NH2在活细胞中对PA的荧光成像能力，采用倒置荧光显微镜对A549、293T活细胞中外源性PA进行荧光成像。在生物体系内，10%的乙醇浓度并不适合与细胞共培养，为了检测活细胞内丙酮酸，本实验培养基中并未加入乙醇，且由图6-B实验结果可以看出，在无乙醇体系中，探针对丙酮酸响应度高，并不影响检测定性结果。此外，体外条件优化实验结果表明，探针浓度5～10 μmol/L 之间对丙酮酸响应较灵敏，考虑到细胞内环境复杂，适当增大探针浓度可使检测结果更显著。结果如图11、12所示，探针R6G-NH2可以穿过细胞膜并进入细胞质。空白对照组几乎没有荧光信号，向培养基中加入10 μmol/L R6G-NH2孵育30 min，显示较弱的荧光信号。向该培养基中分别加入50、100 μmol/L外源性PA继续孵育30 min，可观察到PA浓度依赖的荧光增强现象。

Figure10 Detection of PA in plant tissue

A:Standard curve of pyruvate detected by 2,4-dinitrophenylhydrazine;B:Comparison of the analytical results of onion,scallion and garlic samples determined with the proposed method and 2,4-dinitrophenylhydrazine colorimetry (n=3)

为了考察R6G-NH2对细胞内源PA监测能力，本研究采用低浓度BPA诱导细胞产生PA[24]并进行荧光成像。结果如图13所示，经过BPA诱导的293T细胞荧光显著增强，探针R6G-NH2对细胞内源PA响应灵敏。因此，R6G-NH2有望发展成一种活细胞中PA实时动态荧光成像的分子探针。

4 结 论

启发于细胞内生理环境下α-酮酸与氨基酸之间的转氨作用，以罗丹明为荧光团，肼为识别基团，本研究构建了一类分子开关的“Turn-on”型丙酮酸荧光探针。通过探针分子中酰肼与丙酮酸活泼羰基发生席夫碱反应，诱导吡咯环打开，产生颜色和荧光双重响应。罗丹明6G-酰肼代表探针具有分析灵敏度高、检测快速、选择性好等特点，可消除常见生物分子和阴阳离子、活性氧化物等物质的干扰。体外成功检测了3种生物组织中的丙酮酸。Figure11 A549 Cell fluorescence images of exogenous PA incubated with R6G-NH2

A:Untreated control;B:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L);C:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) in the presence of PA (50 μmol/L);D:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) and in the presence of PA (100 μmol/L)

Figure12 293T Cell fluorescence images of exogenous PA incubated with R6G-NH2

A:Untreated control;B:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L);C:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) in the presence of PA (50 μmol/L);D:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) and in the presence of PA (100 μmol/L)

Figure13 293T Cell fluorescence images of endogenous PA incubated with R6G-NH2

A:Untreated control;B:Cells incubated with BPA (1 nmol/L);C:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L);D:Low-concentrations of BPA (1 nmol/L) induced PA and incubated with R6G-NH2

一定疏水特性的探针分子具有良好的细胞膜穿透性，成功实现了细胞外源性和内源性丙酮酸荧光成像分析。

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