抑制Rab11表达对人膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响

宫雪，于柳，祝兴旺，刘嘉，刘屹立，王平

（中国医科大学附属第四医院泌尿外科，沈阳 110032）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，常规行手术切除，但晚期患者手术疗效较差，放化疗等辅助治疗不敏感，患者生命受到严重威胁。因此，针对膀胱癌的靶向治疗研究具有极其重要的临床意义。Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一个成员［1］，参与再循环内体的形成，在有丝分裂纺锤体形成和定位的过程中发挥不可或缺的作用［2］。据文献［3-6］报道，Rab11与皮肤癌、乳腺癌、食管腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的发病进展有关。本课题组的前期实验通过免疫组织化学方法证实了Rab11在膀胱癌组织中过表达，并与膀胱癌细胞的侵袭深度显著相关。本研究在膀胱癌T24细胞系中转染Rab11 siRNA，抑制Rab11蛋白的表达，以探讨抑制Rab11表达对细胞增殖、细胞周期和侵袭的作用和机制，为晚期膀胱癌的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人膀胱癌细胞系T24 （美国ATCC公司） ；Rab11（美 国Proteintech公 司） ，cyclin D1、cyclin E、基 质 金属蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP9） （美国Cell Signaling公司） ，β-actin （美国Santa Cruz公司） ；Rab11 ONTARGETplus siRNA，阴性对照NonTarget-ing siRNAa （美国Dharmacon公司） ；ECL试剂盒（美国Pierce公司） ；qRT-PCR试剂盒SYBR Green Master Mix Kit（美国Applied Biosystem公司）。发光仪器为DNR BioImaging System （以色列DNR公司），PCR仪为7500 Real-Time PCR System。

1.2 细胞培养与转染

膀胱癌T24细胞系常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，隔天换液。取对数生长期的T24细胞悬液接种于6孔板中 （约1×106/孔） 继续培养24 h，确保细胞密度＞80%后进行转染。转染步骤及剂量参照说明书。将转染Rab11 siRNA的T24细胞作为实验组（Rab11 siRNA组） ，转染Control siRNA的T24细胞作为对照组 （Control siRNA组） 。

1.3 免疫印迹法

转染48 h后，收集T24细胞，裂解提取总蛋白，用BCA法行目标蛋白定量，上样量为20 μ g，电泳，转膜，孵育一抗Rab11（ 1∶800） 、cyclin D1、cyclin E、MMP9（ 1∶1 000） ，β-actin（ 1∶2 000） ，4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育2 h，ECL发光。通过凝胶分析系统扫描目的条带和内参的灰度对比，严格按试剂盒说明书操作。

1.4 CCK8法

取对数生长期的T24细胞，接种后转染，继续细胞培养。于检测细胞增殖率4 h前加入10 μ L CCK8溶液处理细胞，通过酶标仪分析细胞增殖率变化，选用波长为490 nm。采用CCK8试剂盒，按照产品说明操作。

1.5 细胞周期检测

将T24细胞接种后转染，继续培养48 h，收集细胞，用1%的多聚甲醛进行固定，用PBS缓冲液漂洗，用无RNA酶的碘化丙啶 （5 mg/mL） 对细胞进行染色。采用流式细胞仪，分析细胞内核DNA分布的规律，绘制直方图。

1.6 基质胶侵袭实验

将Matrigel用培养液稀释，每孔20 μ L Matrigel进行铺膜 （24孔板） 。转染48 h后，收集T24细胞，用培养液稀释制备细胞悬液 （1×105/mL） 。上室中每孔加入200 μ L细胞悬液，下室中加入含20%胎牛血清的培养液800 μ L，继续培养24 h。取出Transwell小室，PBS缓冲液冲洗，进行苏木精染色，室温干燥过夜。显微镜下对细胞进行计数，重复实验3次。

1.7 实时PCR

按试剂盒步骤提取总RNA，测定浓度及纯度，使用7500 Real-Time PCR System将其逆转录为cDNA，PCR扩增过程中所用内参为β-actin。基因表达的相对量用ΔCt值代表，其中ΔCt =Ct基因-Ct内参，基因扩增倍数的估测方法采用2-ΔΔCt估测法。重复实验3次。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 免疫印迹法检测T24细胞系转染Rab11 siRNA的转染效率

采用免疫印迹法检测转染效率，结果显示，Rab11 siRNA组与Control siRNA组相比，T24细胞系中Rab11表达量显著下调 （图1） 。

图1 免疫印迹法检测Rab11 siRNA的干扰效率Fig.1 RNA interference efficiency of the Rab11 siRNA determined by performing Western blotting

2.2 抑制Rab11表达能抑制膀胱癌细胞的增殖

采用CCK8法分析抑制Rab11表达对细胞增殖的影响，结果表明，Rab11 siRNA组与Control siRNA组相比，第3天时膀胱癌细胞的增殖率明显降低（P ＜ 0.05） ，见图2。

2.3 抑制Rab11表达能抑制膀胱癌细胞周期进程

通过流式细胞术分析抑制Rab11表达对细胞周期进程的影响，结果表明，Rab11 siRNA组与Control siRNA组相比，G1期细胞数目明显上升，S期细胞数目明显下降 （图3） 。

2.4 抑制Rab11表达能抑制膀胱癌细胞的侵袭能力

图2 CCK8实验检测抑制Rab11表达对膀胱癌细胞增殖的影响Fig.2 Effect of Rab11 inhibition on the proliferation of bladder cancer cells determined by performing the CCK8 assay

通过基质胶侵袭实验分析抑制Rab11表达对膀胱癌细胞侵袭能力的影响，结果表明，Rab11 siRNA组与Control siRNA组相比，穿过基质胶的细胞数目明显减少 （分别为96±7和189±11，P ＜0.05），见图4。

2.5 抑制Rab11表达显著下调细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E和侵袭相关蛋白MMP9的表达量

通过免疫印迹法和实时PCR技术分析抑制Rab11表 达 对T24细 胞 系 中cyclin D1、cyclin E和MMP9表达情况的影响，结果表明，Rab11 siRNA组与Control siRNA组相比，细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E和侵袭相关蛋白MMP9的蛋白和mRNA的表达量显著降低（P ＜ 0.05） ，见图5。

3 讨论

图3 流式细胞术分析抑制Rab11表达对膀胱癌细胞周期进程的影响Fig.3 Effect of Rab11 inhibition on cell cycle progression in bladder cancer cells determined by performing flow cytometry

图4 基质胶侵袭实验分析抑制Rab11表达对膀胱癌细胞侵袭能力的影响 ×200Fig.4 Effect of Rab11 inhibition on the invasive ability of bladder cancer cells determined by performing the Matrigel invasion assay ×200

图5 免疫印迹法和实时PCR检测转染Rab11 siRNA的T24细胞系中cyclin D1、cyclin E和MMP9的表达情况Fig.5 Expression of cyclin D1，cyclin E，and MMP9 in T24 cells transfected with the Rab11 siRNA determined by performing Western blotting and RT-PCR

Rab11能够调控Rac活性的相对水平，并且在多细胞运动型结构形成过程中有利于单个细胞的形成。Rab11能调节再循环内体的形成、运输，并引导携带受体的膜泡锚定于质膜之上，从而实现了受体和脂质在细胞内的循环利用。近年文献［4-5］报道，Rab11与皮肤癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生进展相关。Rab11能够上调E-cadherin的表达，进而诱导结直肠癌细胞的转化［6］。以上研究表明，Rab11与恶性肿瘤的发生发展密切相关。本课题组前期实验已证实，Rab11在膀胱癌组织中过表达，并与肿瘤侵袭深度显著相关，表明Rab11在膀胱癌的发病机制中发挥重要作用。本研究在膀胱癌T24细胞系中转染Rab11 siRNA，分析抑制Rab11表达对癌细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力的影响，并探讨抑制Rab11表达对细胞周期相关因子cyclin D1、cyclin E和侵袭相关因子MMP9的作用。

本研究采用Rab11 siRNA转染T24细胞，下调T24细胞系中 Rab11的表达量。结果表明，抑制Rab11表达后，细胞的增殖能力受到明显抑制。通过流式细胞术分析抑制Rab11表达对细胞周期进程的影响，结果表明细胞周期进程受到阻遏，G1期到S期的转化受到抑制。为进一步研究抑制Rab11表达对细胞周期进程的作用机制，检测了细胞周期相关蛋白的表达情况，结果发现抑制Rab11表达能够下调cyclin D1和cyclin E的表达量。cyclin D1和cyclin E蛋白在G1～S期的转化过程中发挥重要作用［7-8］。本研究结果表明，在T24细胞系中Rab11通过调控cyclin家族蛋白的表达，进而调控癌细胞的增殖和细胞周期进程。

基质胶侵袭实验结果表明，转染了Rab11 siRNA的T24细胞系其侵袭能力明显降低。MMP9在细胞中的主要作用是减少基底膜中胶原蛋白的含量，在膀胱癌细胞侵袭和转移的过程中至关重要［9-12］。深入研究受Rab11调控的与侵袭能力相关的蛋白质，发现MMP9可能是Rab11蛋白作用的一个潜在靶基因。本研究结果显示，抑制Rab11表达后MMP9的表达量也明显降低。因此，Rab11可能是通过调控侵袭相关因子MMP9的表达量进而调控膀胱癌细胞的侵袭和转移。

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