microRNA-1183通过抑制CBL-B的表达促进胃癌细胞的增殖及转移

范一博，车晓芳，赵欢，胡雪君，曲秀娟，刘云鹏

（中国医科大学附属第一医院 1. 肿瘤内科； 2. 呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科，沈阳 110001）

microRNA （miRNA） 是一类长度约为22个核苷酸，由内源基因编码的非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控［1］。近年来，越来越多的研究［2-7］显示，microRNA参与多种肿瘤的增殖和转移，影响肿瘤患者的预后。然而，microRNA-1183是否促进胃癌细胞中的增殖和转移尚不清楚。本研究探讨了microRNA-1183对胃癌细胞MGC803增殖和转移的影响，以及CBL-B和Akt通路在其中的作用。研究结果为进一步明确microRNA-1183对胃癌细胞的增殖和转移机制提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

Akt和phosph-Akt抗体购自美国Cell Signaling公司，CBL-B和β-actin抗体购自美国Santa Cruze 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：胃癌细胞系MGC803购自上海细胞库。人胃癌细胞MGC803生长于含有12 U/L庆大霉素、100 mL/L灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37 ℃、5%CO2的孵育箱内培养，2 d左右传代1次。所有实验均采用对数生长期细胞。

1.2.2 MTT法检测胃癌细胞的增殖：取对数生长期的胃癌细胞MGC803细胞株接种于96孔板内，待细胞贴壁后转染microRNA阴性对照及microRNA-1183模拟物，72 h后每孔加入MTT溶液 （5 mg/mL） 25 μ L，继续孵育4 h，弃掉孔内上清液。加入二甲亚砜200 μ L/孔，振荡至结晶物充分溶解，在酶联免疫测定仪上选择570 nm波长，空白孔调零，测定各孔吸光值，计算两者的增值率。

1.2.3 Transwell法检测胃癌细胞的转移：取对数生长期的胃癌细胞MGC803，胰酶消化细胞后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入无血清的RPIM 1640培养基，细胞计数至1×105/mL加入Transwell小室（Corning） 上室。下室加入2.5%胎牛血清的RPIM培养基。37 ℃培养箱培养24 h。 取出Transwell，脱脂棉擦拭表面的细胞，PBS冲洗上室。瑞士吉姆萨染色后，PBS冲洗风干，显微镜下计数细胞数。实验重复3次。

1.2.4 Western blotting检测蛋白表达：分别收集转染microRNA阴性对照及microRNA-1183模拟物的胃癌细胞MGC803，冰上裂解后，提取上清的蛋白，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。将样品 （30 μ g/道） 在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳约3 h，然后转印至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TTBS封闭1 h后，按Marker标记的分子量剪裁转印膜，分别加入兔抗人CBL-B抗体 （1∶1 000） 、pAkt抗体 （1∶500） 、Akt 抗体 （1∶1 000） 和 β-actin抗体 （1∶1 000） 4 ℃过夜。TTBS洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（1∶800） 或羊抗兔二抗 （1∶800） 室温作用30 min后，再应用TTBS洗4次，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测系统检测：将质粒 （500 ng） 、microRNA-1183模拟物或阴性对照（50 nmol/L） 及pRL-TK （5 ng） 瞬时转染至胃癌细胞MGC803细胞 72 h后，双荧光报告系统检测荧光素酶的活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。所得数据均为3次独立实验结果，以±s表示。2组间比较采用 t 检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA-1183促进胃癌细胞MGC803的增殖和转移

为证实microRNA-1183对胃癌细胞增殖的作用，将microRNA-1183瞬时转染到MGC803细胞，实时PCR结果显示，与对照组相比，microRNA-1183的表达升高了4.2倍 （图1A） 。同时，MTT法结果证实，microRNA-1183可促进胃癌细胞MGC803的增殖 （图1B） 。Transwell法结果证实，microRNA-1183可促进胃癌细胞MGC803的转移 （图1C） 。

2.2 microRNA-1183直接与CBL-B 3’UTR区结合

为了明确microRNA-1183促进胃癌细胞增殖的机制，通过生物信息学网站TargetScan及microRNA.org预测microRNA-1183的靶基因，结果显示，CBL-B等是microRNA-1183的靶基因。BLAST对比分析结果显示，microRNA-1183与CBL-B的3’UTR区有直接结合位点 （图2A） 。进一步过表达microRNA-1183后，CBL-B的表达以浓度依赖的方式下调 （图2B） 。荧光报告素酶结果证实，转染模拟物microRNA-1183后，荧光素酶的活性明显降低 （图2C） ，说明CBL-B是microRNA-1183的靶基因。

2.3 CBL-B抑制胃癌MGC803细胞的增殖

为证实CBL-B对胃癌MGC803增殖的作用，Western blotting验证CBL-B的敲除效率情况 （图3A） 。MTT法结果显示，瞬时敲除CBL-B后，细胞增殖的能力明显增强。Transwell法结果显示，敲除CBL-B后，细胞的转移能力明显增强。结果表明，CBL-B抑制了胃癌细胞MGC803的增殖 （P ＜ 0.01，图3B） 。

2.4 microRNA-1183/CBL-B/Akt信号轴促进胃癌细胞MGC803的增殖与转移

图1 microRNA-1183促进胃癌细胞MGC803的增殖和转移Fig.1 microRNA-1183 promotes the proliferation and metastasis of MGC803 cells

图2 CBL-B是microRNA-1183的靶基因Fig.2 CBL-B is the target gene of microRNA-1183

Western blotting检测microRNA-1183瞬时转染到MGC803细胞48 h后，CBL-B及下游分子Akt的表达变化。结果表明，瞬时转染microRNA-1183后，CBL-B的表达明显下调，伴随Akt的活化明显增强，见图4。

3 讨论

microRNA的异常表达可影响多种肿瘤患者的预后［2-7］。已有文献［8］报道，microRNA-1183在类风湿性关节炎的患者中高表达，且可作为诊断疾病的分子标志物。然而，目前microRNA-1183在肿瘤中发挥的作用尚未见报告。本研究证实，胃癌中microRNA-1183可促进其增殖及转移。

既往研究［8］显示，胃癌患者血浆microRNA-1183的表达可作为诊断类风湿关节炎的生物标志物，其中CXCR4、 EGF和EGFR都是其靶基因。然而，microRNA-1183是否存在其他的靶基因，及其在胃癌中的增殖作用尚不明确。本研究结果显示，microRNA-1183可以通过浓度依赖的方式促进胃癌细胞MGC803的增殖和转移，进一步提示其参与胃癌细胞的恶性转化。

图3 CBL-B抑制MGC803细胞的增殖与转移Fig.3 CBL-B inhibited the proliferation and metastasis of MGC803 cells

图4 Western blotting过表达microRNA-1183后CBL-B、pAkt和Akt的表达Fig.4 Western blotting shows the expression of CBL-B，p-Akt，and Akt in MGC803 cells overexpressing microRNA-1183

既往关于microRNA-1183的功能及靶基因仅有1篇文章报告。通过TargetScan及microRNAorg预测CBL-B可能是microRNA的靶基因。CBL-B是一种抑癌基因，通过泛素化降解受体或非受体酪氨酸激酶，从而抑制细胞的生长、分化和凋亡［9-10］。本研究发现，过表达microRNA-1183后CBL-B的表达明显下调，并伴随着Akt的活化。这些结果提示，microRNA-1183通过负向调控CBL-B促进胃癌细胞的增殖及转移。

综上所述，microRNA-1183可促进胃癌细胞的增殖和转移，其通过抑制CBL-B的表达促进了Akt的活化，提示microRNA-1183/CBL-B/Akt通路是促进胃癌细胞增殖和转移的机制之一。本研究为进一步明确胃癌细胞的增殖和转移机制，寻找治疗胃癌的靶分子提供重要的科学意义和潜在的临床应用价值。

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