β-淀粉样蛋白诱导的阿尔茨海默病大鼠模型中BDNF与TRPC3的关系

张利华，张丽艳，张小康，徐超龙，周义

（沈阳医学院基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110034）

阿尔茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 又称老年痴呆症，是一种以记忆、学习、认知功能改变为主要特征的神经系统退行性疾病。病因假说很多，其中β-淀粉样蛋白 （β-amyloid protein，A β） 异常沉积占主导地位。其主要病理特征是在患者大脑皮质、海马区出现老年斑和神经元纤维缠结，此外还有神经元缺失、神经元突触异常等病理改变。脑源性神经营养因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是中枢神经系统中分布最广泛的营养因子，在突触可塑性、神经元存活方面起着关键作用。最近的研究［1］报道，AD患者的血清中BDNF水平降低，且发现健康老年受试者的脑脊液中BDNF水平低下可能预示着未来会出现认知衰退。哺乳动物中的经典瞬时受体电位通道蛋白 （canonical transient receptor potential channel，TRPC） 是一种非典型钙离子通道，与神经系统的生长、增殖、分化和凋亡密切相关。BDNF通过激活TRPC3促进树突棘的生长发育［2］。卡洛西汀通过促进TRPC6和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白的表达从而治疗脑缺血损伤［3］。在癫痫大鼠海马神经元初代培养中，BDNF和TRPC3表达增加对癫痫引起的细胞损伤起保护作用［4］。在视网膜缺血性损伤的研究中发现，BDNF/酪氨酸激酶受体B通过调节TRPC3/6通道的表达进而发挥神经节细胞的保护作用。

本课题组的前期研究［5］发现，在A β诱导的AD小鼠模型中，TRPC4表达增加。但目前关于BDNF和TRPC3在A β所致的AD模型中的关系及作用机制尚不清楚。本研究采用SD大鼠侧脑室注射寡聚型A β 1-42的方法模拟AD［6］，利用逆转录聚合酶链反应 （RTPCR） 和Western blotting检测大鼠海马组织中TRPC3和BDNF mRNA和蛋白表达，探讨它们之间的关系，为AD发病机制研究提供新的证据，同时也为预防和治疗AD提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物：24只5周龄200～220 g的SPF级雄性SD大鼠 （辽宁长生生物技术有限公司） 。

1.1.2 试剂：A β和BDNF兔单克隆抗体 （英国Abcam公司） ；重组人源BDNF （美国Peprotech公司） ；总RNA小量制备试剂盒 （美国Axygen公司） ；逆转录试剂盒 （加拿大Abm公司） ；BCA 蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 （上海碧云天公司） ；TRPC3兔多克隆抗体 （台湾Arigo公司） ；β-actin小鼠单克隆抗体和辣根酶标记山羊抗兔IgG （H+L）（美国Proteintech公司） ；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L） （北京中杉金桥公司） 。

1.2 方法

1.2.1 A β 1-42寡聚化处理：注射前，将A β 1-42室温放置1 h，低速离心10 min，溶解在灭菌PBS溶液中 （浓度为1 μ g/μ L） ，并在37 ℃恒温箱中孵育48 h诱导寡聚化，放置冰上备用。

1.2.2 AD模型制备：大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g） 麻醉，头部消毒后将皮肤沿矢状线切开 1 cm，棉签蘸碘伏消毒，剔除骨膜，完全暴露颅骨前囟，置于脑立体定位仪上，侧脑室导管放置位置根据《大鼠脑立体定位图谱》确定，前囟后 0.8 mm，中线向右旁开 1.5 mm，深度3.5 mm。置管后在管周前、左、右3个位置分别拧入小螺丝半固定，涂以牙科水泥固定，晾干后缝合。肌注青霉素5 d预防感染。待手术应激消失后，用微量注射器经导管缓慢注射A β 1-42 10 μ L，注射速度约为2 μ L/min，注射结束留针3 min，使溶液充分弥散。对照组注射同等剂量的PBS溶液。

1.2.3 BDNF给药：根据说明书溶解和稀释BDNF，分装后置于-40 ℃冰箱低温保存，避免反复冻融。A β 1-42给药14 d后即水迷宫实验前1 d，从第15天起，给予AD+BDNF组大鼠BDNF水溶液，剂量为10 μ L（0.025 μ g/μ L） ，持续给药5 d。

1.2.4 Morris水迷宫行为学检测：A β 1-42给药后第16天，利用MT-200 Morris 水迷宫跟踪分析系统 （成都泰盟科技有限公司） 检测各组大鼠学习和记忆能力。前5 d进行定位航行实验，将待测大鼠头部面向池壁放入水中，让其寻找目标象限内的隐藏平台，所用时间即逃避潜伏期，依据该时间的长短检测大鼠的空间学习能力，3次/d，平台位置不动，象限不重复。第6天进行空间探索实验，将平台撤去，记录大鼠穿越平台次数以及在平台所在象限停留时间，以检测大鼠的空间记忆能力。

1.2.5 RT-PCR 检测TRPC3和BDNF mRNA的表达：Morris水迷宫实验结束后将大鼠断头取海马组织，-80 ℃超低温冰箱保存，以备RT-PCR实验以及Western blotting实验使用。提取大鼠海马组织总RNA后进行逆转录。以逆转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增，所需引物由金斯瑞生物科技公司合成。β-actin上游引物5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，下游引物5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’；BDNF上游引物5’-CTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCG-3’，下游引物5’-CAGCCTTCCTTCGTGTAACCCAT-3’；TRPC3，上游引物5’-CTGGCCAACATAGAGAAGGAGT-3’，下游引物5’-CACCGATTCCAGATCTCCAT-3’。琼脂糖凝胶成像结果采用Gel Image System软件进行分析。

1.2.6 Western blotting 检测 TRPC3 和BDNF蛋白的表达：向低温保存的海马组织中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200 μ L，12 000 r/min离心5 min。取上清液，采用 BCA 法得出标准曲线，根据样品吸光度计算得出蛋白浓度。蛋白上样量为30 μ g/10 μ L，室温下SDS-PAGE凝胶电泳1 h，TRPC3 （分子量91 000） 采用湿转方式转膜2 h，BDNF （分子量15 000） 采用半干转方式转膜20 min，放入5%脱脂牛奶中摇床封闭1 h，加入适度稀释度的一抗TRPC3 （1∶2 000） 、BDNF （1∶2 000）、 β-actin （1∶5 000） 4 ℃孵育过夜。翌日TBST漂洗15 min×3次，加入适度稀释的二抗（1∶2 000） ，冰上孵育2 h，TBST漂洗15 min×3次，最后，用化学发光成像系统 （中国天能公司） 进行ECL显影，用Gel Image System 软件对实验结果进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BDNF对AD大鼠空间学习记忆能力有改善作用

侧脑室导管A β 1-42给药14 d后，从第15天开始，BDNF连续给药5 d，期间进行水迷宫实验。第5天大鼠逃避潜伏期AD组较PBS组延长，有统计学差 异［分 别 为（31.06±4.01） s和（24.23±4.62） s，P ＜ 0.05］；第6天穿越平台次数AD组较PBS组减少（分 别 为3.25±0.45和6.62±0.46，P ＜ 0.05） ，表 明AD组大鼠的空间学习记忆能力下降。而第5天大鼠逃避潜伏期AD+BDNF组较AD组缩短［分别为（23.30±4.84） s和（31.06±4.01） s，P ＜ 0.05］； 第6天穿越平台次数AD+BDNF组较AD组增加 （分别为5.83±0.75和3.25±0.45，P ＜ 0.05） ，表明BDNF对AD大鼠空间学习记忆能力有改善作用。见图1。

图1 Morris 水迷宫实验中各组大鼠行为学比较Fig.1 Behavioral comparisons of each group of rats in the Morris water maze

2.2 BDNF促进TRPC3 mRNA的表达

RT-PCR结果显示，AD组与PBS组相比，BDNF和TRPC3 mRNA相对含量均降低 （P ＜ 0.05） 。AD+BDNF组与AD组相比，TRPC3 mRNA相对含量增加 （P ＜0.05） 。见图2。

2.3 BDNF促进TRPC3 蛋白的表达

Western blotting结果显示，AD组与PBS组相比，BDNF和TRPC3 蛋白相对含量均降低 （P ＜ 0.05） ，AD+BDNF组与AD组相比，TRPC3 蛋白相对含量增加 （P ＜ 0.05） 。见图3。

3 讨论

研究［7］表明，A β在脑内沉积形成老年斑是AD最具特征的病理改变，与大脑认知障碍密切相关。A β在AD的发病机制中起着核心作用，但它通过何种机制造成神经元损伤，尚不清楚。在转基因AD小鼠脑组织中观察到BDNF的降低可能会促进神经元萎缩和突触损伤，而BDNF的上调可以控制AD的认知衰退［8］。本研究中，AD组大鼠BDNF表达下降，空间学习记忆能力减退；当给予AD大鼠一定剂量的BDNF时，可明显改善其空间学习记忆能力，与之前ZHANG等［9］的研究结果一致。

图2 RT-PCR检测大鼠海马区BDNF和TRPC3 mRNA的表达水平Fig.2 Expression of BDNF and TRPC3 mRNA in the hippocampus of rats detected by RT-PCR

图3 Western blotting检测各组大鼠海马区BDNF 和TRPC3蛋白表达Fig.3 Expression of BDNF and TRPC3 protein in the hippocampus detected by Western blotting

有研究［10］表明，在心肌缺血性损伤及癫痫大鼠模型中，BDNF与TRPC3/6协同作用，对神经元损伤起保护作用。本研究中，AD组大鼠TRPC3表达下降，当给予AD大鼠一定剂量的BDNF时，TRPC3 mRNA和蛋白水平均明显增加，说明BDNF可能通过上调TRPC3从而发挥其改善AD大鼠认知障碍的作用，这在AD模型中尚属首次发现。

有研究［11］表明，BDNF通过钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶激活TRPC5或TRPC6通道从而诱导谷氨酸亚基1翻译和突触生长。也有研究［12］表明，哌嗪类化合物通过激活DAG，进而引起TRPC3/6/7介导的Ca2+内流，发挥BDNF样神经营养作用。但在AD模型中，BDNF通过何种途径调控TRPC3的表达，仍需进一步的试验证实。

综上所述，本研究表明，BDNF可能通过上调TRPC3表达，从而发挥其对AD大鼠认知障碍的改善作用，但其具体机制有待研究。这可能对临床预防和治疗AD有一定帮助。

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