Sirtuins在缺血再灌注损伤中作用的研究进展

王亚楠，黄林，王士雷

(青岛大学附属医院，山东青岛 226555 )

研究证实，组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰在基因表达调控中发挥重要作用。缺血再灌注损伤是缺血组织在恢复血液灌注之后结构和功能进一步破坏。研究发现，线粒体分裂是导致脑缺血再灌注损伤的重要原因[1]，keap1/Nrf2/ARE为经典的氧化应激调控通路，在缺血再灌注损伤过程中起重要作用。Sirtuins是一种去乙酰化酶，可通过去乙酰化作用影响多种蛋白之间的活动以及相互作用，是基因表达调控过程中的关键因子。Sirtuins包括两类，一类是在酵母菌中表达的Sir2；另一类是发现于哺乳动物体内的家族蛋白，即通常所说的Sirtuins。本文主要阐述Sirtuins从线粒体及keap1/Nrf2/ARE通路激活方面在缺血再灌注损伤中的器官保护作用及其机制。

1 Sirtuins概述

Sirtuins家族高度保守，目前已鉴定了7种哺乳动物Sirtuins同系物(SIRT1～SIRT7)。其中SIRT1、SIRT6和SIRT7定位于细胞核内，SIRT3、SIRT4和SIRT5定位在线粒体中，而SIRT2主要定位于细胞质中。Sirtuins家族主要表现为两种酶活性：NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶活性和ADP-核糖基转移酶活性。Sirtuins家族能去乙酰化各种底物，如转录因子、代谢酶和组蛋白；控制许多生物学过程，包括细胞生长代谢、细胞凋亡和自噬等。其中SIRT1和SIRT3与缺血再灌注损伤密切相关。

1.1 Sirtuins激活剂 白藜芦醇能激活SIRT1使自噬相关蛋白LC3去乙酰化，介导α-突触核蛋白的自噬降解，从而改善神经毒素导致的小鼠运动缺陷和病理变化[2]。研究发现，白藜芦醇类似物补骨脂酚(BAK)可上调SIRT1，随后触发PGC-1α表达，改善下游SDH、COX、SOD活性及线粒体氧化还原电位，导致抗凋亡因子Bcl2水平升高和促凋亡因子Caspase-3和Bax水平降低[3]。紫檀芪(PTE)也是白藜芦醇的一种类似物，SIRT1抑制剂EX527可抵消PTE对IR相关肌肉损伤的保护作用[4]。姜黄素(Cur)可调节SIRT1的活性，Sirtinol和SIRT1 siRNA各自通过抑制SIRT1信号传导阻断Cur介导的心脏保护作用，表明Cur预处理通过激活SIRT1信号减少IR诱导的线粒体氧化损伤[5]。木犀草素可能通过激活SIRT1信号通路，或直接影响Nrf2-Keap1复合物来维持小鼠肝脏中Nrf2的产生[6]。研究还发现，槲皮素、小檗碱、儿茶素、酪醇、阿魏酸、氯硝柳胺、malvidin等均能刺激SIRT1，这些物质与不同信号传导途径(NAD、NAM、AKT、ERK、AMPK和mTOR)相互作用，使得SIRT1表达增加[7]。跑台运动可能通过激活阿尔茨海默病小鼠模型中SIRT1信号传导来减少β淀粉样蛋白产生[8]。

香豆素(C12)是一种新型SIRT3激活剂，可与SIRT3高亲和力结合，促进锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的去乙酰化和活化[9]。和厚朴酚存在于线粒体中，可将SIRT3表达提高近两倍，提示和厚朴酚可能直接与SIRT3结合并进一步增强其活性，减少ROS生成，逆转小鼠的心力衰竭和心肌纤维化[7]。薯蓣皂甙能上调SIRT3水平，促进SOD2、Nrf2和GST蛋白表达，并抑制Keap1表达以增强抗氧化能力，显示出对果糖诱导的肾缺血再灌注损伤的保护作用[10]。

1.2 Sirtuins抑制剂 在哺乳动物中，线粒体融合是通过外膜融合蛋白mitofusins(MFN1和MFN2)和内膜融合蛋白视神经萎缩1(OPA1)发生的；通过线粒体分裂动力蛋白Drp1和其招募蛋白Fis1促进细胞裂变。研究发现，Sirtuins脱乙酰酶抑制剂烟酰胺(NAM)能促进MFN1降解；siRNA介导的SIRT1敲低可引起MFN1减少，而SIRT1过表达则增加其水平[11]；在NCSU-23培养基中用合适浓度的sirtinol(SIRT1/2抑制剂)培养体外受精的猪胚胎，sirtinol组SIRT2水平显著降低，增加LC3转录物和LC3蛋白诱导自噬且caspase-3表达显著升高，提示Sirtuins可能通过修饰自噬和细胞凋亡来对抗氧化应激反应[12]；腹腔注射Sirtuins抑制剂Tenovin6，发现SIRT3激活，其介导线粒体亲环蛋白cypD去乙酰化，可降低mPTP开放程度，抑制细胞凋亡，减轻大鼠肾IRI[13]。衰竭心肌组织miR-195表达升高涉及直接的3′-UTR靶向下调SIRT3可增加丙酮酸脱氢酶和ATP合酶的乙酰化抑制酶活性，影响心脏的能量代谢[14]。

2 Sirtuins在缺血再灌注损伤中的器官保护作用及其机制

哺乳动物Sirtuins可与FOXO、PGC-1α、SOD2、Ku70和Nrf2等蛋白相互作用，调控缺血再灌注损伤过程。缺血再灌注损伤机制复杂，包括线粒体损伤、钙超载、氧自由基累积、炎症反应及细胞凋亡等，其中线粒体与缺血再灌注损伤的病理机制层层交叉、密切相关。

2.1 SIRT1 SIRT1可将许多转录因子及核共激活因子去乙酰化，并参与包括心脑肾在内的多种器官与组织的保护作用。SIRT1的去乙酰化酶活性在IRI心脏保护中起关键作用。高水平SIRT1使Nrf2蛋白的去乙酰化修饰增多，Nrf2蛋白表达升高，可减轻心肌IRI引起的炎症和氧化应激。亦有研究发现，抑制SIRT1制造乙酰化条件可导致Nrf2的核定位增加，促进Nrf2与DNA结合并增强基因转录；去乙酰化则使Nrf2重新定位于细胞质内[15]。去乙酰化酶和Nrf2激活的关系值得进一步探讨。研究发现，SIRT1激活剂白藜芦醇及其类似物补骨脂酚、紫檀芪分别在心肌、骨骼肌等缺血再灌注中发挥保护作用[3,4]。姜黄素能减轻心肌IRI，且能通过激活Nrf2抑制线粒体分裂而改善胰岛素抵抗。Huang等[16]发现，伴随着去乙酰化的作用和Nrf2的泛素化水平降低，SIRT1可明显增强Keap1/Nrf2/ARE通路活性，包括降低Keap1表达，促进Nrf2核内移，增强与ARE结合能力和转录活性，增加血红素加氧酶1(Nrf2靶基因)蛋白表达，最终抑制晚期糖基化终产物处理的肾小球系膜细胞中ROS过量产生，延缓糖尿病肾病的进展。Nrf2也能正面调节SIRT1的蛋白表达和去乙酰酶活性水平，推测SIRT1与Keap1/Nrf2/ARE抗氧化途径之间形成正反馈环，发挥器官保护作用。

2.2 SIRT3 SIRT3介导的线粒体蛋白脱乙酰作用在心脑等疾病中均发挥重要作用。全脑缺血再灌注损伤后，大鼠大脑运动皮质内SIRT3表达随再灌注时间延长而降低。SIRT3缺乏可在缺血后恢复过程中加剧心功能不全，并增加线粒体通透性转换孔(mPTP)开放和ROS产生[17]。SIRT3主要在线粒体中表达，能使线粒体蛋白去乙酰化和活化，改善线粒体功能[18]。Meng等[19]研究发现，硫氢化钠(NaHS)增加SIRT3启动子活性和SIRT3表达后，能逆转线粒体功能障碍，而沉默SIRT3则可废除此功能；同时发现，NaHS可抑制Drp1、Fis1，但SIRT3敲除小鼠不能被抑制。SIRT3能够使线粒体融合蛋白OPA1去乙酰化并提高其GTP酶活性，OPA1的SIRT3依赖性激活有助于保护线粒体网络，调节线粒体动力学，提高线粒体功能。SIRT3超表达可减少SOD2乙酰化水平，并刺激Nrf2核转位，提高抗氧化能力。去乙酰化核蛋白Ku70可减少Drp1相关的线粒体转位，减弱叔丁基过氧化氢诱导的小鼠肝细胞线粒体分裂。SIRT3去乙酰化PGC-1α可促进线粒体生物合成[20]。SIRT3可能如SIRT1一样，与Nrf2之间存在正反馈环，因为Nrf2可通过与SIRT3启动子的直接相互作用来控制SIRT3表达，而PGC-1α与NRF2作为转录共激活因子相互作用，其减少可使SIRT3转录减少，导致细胞凋亡[21，22]。

SIRT3对缺血再灌注损伤的器官保护作用目前存在争议。有学者认为，脑缺血再灌注后通过未知的SIRT3活化机制增强线粒体神经酰胺合酶的去乙酰化，导致神经酰胺的积累和线粒体功能障碍，累积的神经酰胺抑制呼吸链活动，导致ROS增加和活化的Bax表达增加，使脑损伤加重。而SIRT3基因可消融减少神经酰胺，保留线粒体呼吸链功能，抑制ROS生成和氧化损伤，并减轻中风小鼠模型的脑组织损伤[23]。

2.3 其他Sirtuins成员 细胞质中的SIRT2在氧化应激条件下通过抑制caspase-3活化和降低SOD的水平，在细胞凋亡和氧化信号传导中发挥作用。COPD中SIRT2活性降低可能导致Nrf2乙酰化增加，Nrf2稳定性降低和抗氧化剂防御功能受损[24]。SIRT2能增加融合相关蛋白Mfn2并减少线粒体相关的Drp1，还能减弱线粒体DNA相关蛋白TFAM的下调，促进线粒体质量的增加[25]。但也有研究表明，SIRT2通过结合和去乙酰化Nrf2，促进其降解，随后Nrf2总细胞水平及核水平降低[26]。SIRT4与SIRT5均定位于线粒体中，哺乳动物SIRT4抑制与饮食剥夺相结合，可能防治缺血再灌注损伤[27]。SIRT5可靶向MiD51、Fis1、Drp1降低线粒体片段化，保护线粒体功能，减轻心肌缺血再灌注损伤[28]。在神经母细胞瘤细胞中，SIRT6过表达可增加总Nrf2、核Nrf2及其靶基因HO-1和SOD水平，减轻氧化应激反应，减弱OGD/R诱导的细胞死亡，其保护作用可被NRF2敲低阻断，这些证据表明SIRT6可通过激活Nrf2抑制氧化应激保护大脑，使其免受缺血再灌注损伤[29]。SIRT6上调能够维持氧化稳态和线粒体功能，抑制炎症反应和MAPK信号传导，最终减弱细胞凋亡和自噬相关的肝细胞死亡，使肝脏免受缺血再灌注损伤[30]。

综上所述，Sirtuins家族多个成员均涉及线粒体功能，且在器官保护尤其是缺血再灌注损伤中发挥作用，目前其在缺血再灌注损伤中的器官保护作用机制仍未阐明，依旧争议存在。Sirtuins可以调节Nrf2产生不同影响，其与Nrf2、线粒体及缺血再灌注之间的作用机制仍需进一步探讨。

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