Slit2/Robo1信号通路与肿瘤相关性的研究进展

沈益飞, 张云坤

(南京医科大学附属常州市第二人民医院 骨科, 江苏 常州, 213003)

1988年 Rothberg等[1]发现果蝇的中枢神经中线胶质细胞可合成Slit蛋白，其缺乏可导致纵行传导通路和交叉(联合)神经元轴突在中线发生聚集异常。1998年, Kidd等[2]首次提出Roundabout(Robo)蛋白是Slit的受体，为进一步研究Slit蛋白的功能奠定了基础。Slit-Robo通路包括Slit分泌蛋白家族(Slit1、2、3)及其特异性受体(Robo1、2、3、4), 其中Slit2/Robo1信号通路最初发现是与中枢神经系统发育有关[3-5], 深入研究[6-8]发现Slit2与Robo1相互作用还可以调节白细胞趋化性、中胚层的迁移以及血管平滑肌细胞的迁移。近年来，越来越多的研究发现, Slit2和Robo1的相互作用可以诱导肿瘤的发生。研究[9-10]表明, Slit2和Robo1的启动子在几种不同类型的癌症中是高甲基化的, Slit2/Robo1参与多种不同的肿瘤细胞活动过程，比如增殖和迁移。本研究对Slit2/Robo1在不同肿瘤中的作用综述如下。

1 Robo1、Slit2基因及结构特征

人类Robo1基因位于人染色体的3p12.3, 其编码跨膜蛋白受体。Robo1蛋白包含5个免疫球蛋白结构域, 3个纤连蛋白III结构域, 1个跨膜结构域和1个胞内片段。其细胞内区包含4个特定的保守基序，即CC0、CC1、CC2和CC3。Robo1胞外的IgG结构域被认为是与配体Slit2结合所必需的，胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部至内部骨架的传递[11]。

Slit2基因定位于人染色体4p15.2, 编码人类与果蝇 Slit2 同源的细胞外基质分泌性糖蛋白，是 Slit 基因家族(Slit1～3)的一员，其主要功能是在中枢神经系统发育过程中调节轴突导向和神经细胞的迁移[12]。Slit2蛋白的结构包括1个信号肽、4个独特的富含亮氨酸重复单位(LLR)D1-D4, 其后连接9个类似表皮生长因子(EGF)重复区(果蝇为7个), 1个群集层黏连蛋白-基底膜蛋白多糖-Slit的保守隔离模体, 1个富含半胱氨酸区。LLR区为与Robo1相互作用及轴突导向作用所必需, EGF重复区和Slit的弥散有关，模体具有调节蛋白-蛋白、基质-蛋白的相互作用的功能[13-14]。

2 Slit2/Robo1与脑胶质瘤

鉴于Slit2/Robo1信号通路在神经发育过程中起着重要作用，研究人员最早将目光投向了其在神经系统肿瘤中的作用。脑胶质瘤组织中的Slit2基因启动子出现异常甲基化，是导致Slit2的表达下调的主要原因[15]。Li等[16]通过表达谱分析对比正常脑组织及脑胶质瘤组织中Slit2和Robo1的表达量，发现Slit2在脑胶质瘤组织中的表达量明显低于正常组织，且随着肿瘤分级的升高而逐渐降低，而Robo1的在脑胶质瘤组织中的表达明显高于正常组织，预后生存分析Slit2、Robo1均阳性表达的患者生存率明显优于Slit2阴性表达、Robo1阳性表达患者。在脑胶质瘤中, Slit2的表达与Robo1的表达具有显著负相关性, Slit2的低表达和Robo1的高表达可能与胶质瘤的侵袭性、恶性进展以及不良预后有着密切的关系，且Slit2的表达缺失和Robo1表达增高可能具有协同作用，二者的差异表达共同促进了胶质瘤的生成，在胶质瘤的发病以及进展中发挥着重要作用。

Slit2/Robo1影响胶质瘤发生发展的机制目前并未明确。Jean J等[17]发现在多种神经胶质瘤细胞系中, Slit2的表达量较正常人星形胶质细胞均有明显下调，通过体内外实验证明Slit2通过其受体Robo1抑制胶质瘤细胞中Cdc42的活性，从而通过抑制Cdc42-GTP活性来特异性地抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。最新研究发现，微小RNA(micro-RNA)可以通过Slit2/Robo1信号通路调控胶质瘤的发生发展。JIAN等[18]发现, microRNA218(mi-218)的过表达可以促进胶质瘤细胞中Slit2的表达，同时降低Robo1的表达，从而抑制脑胶质瘤细胞的侵袭力。

3 Slit2/Robo1与消化系统肿瘤

3.1 Slit2/Robo1与食管癌、胃癌、结直肠癌

Ruo-Chia等[19]通过免疫组织化学、甲基化测序等技术发现，食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中Slit2启动子高甲基化，导致Slit2蛋白表达降低。体内外实验发现，敲除Slit2可增强ESCC细胞迁移，而Slit2稳定的过表达则减弱了ESCC细胞迁移。Slit2/Robo1在胃癌的发生和转移过程中发挥重要作用。Kim等[20]对11个胃癌细胞系、96对胃癌组织和相邻正常胃组织中的Slit2表达和甲基化情况进行了分析，发现Slit2 在早期胃癌和晚期胃癌中均发现甲基化。Shi等[21]研究发现，在胃癌细胞中干扰Slit2表达会增加AKT磷酸化，从而活化抗凋亡信号，抑制GSK3β活性并诱导β-catenin活化入核，最后激活AKT/β-连环蛋白介导的肿瘤生长信号通路，促进胃癌生长和转移。Huang等[22]比较结直肠癌组织与癌旁组织发现，CRC组织中Slit2基因的启动子广泛超甲基化从而导致Slit2表达减少，进一步研究机制发现，结直肠癌细胞系LoVo、HCT116细胞中的泛素特异性蛋白酶33(USP33)与Robo1相互作用，增强细胞内Slit2表达，进而抑制肿瘤转移 。Feng Y等[23]通过免疫沉淀(IP)、免疫荧光(IFCRC)等研究方法发现，在结直肠癌细胞中srGAP1是Robo1的相互作用蛋白, srGAP1是CRC中Slit2信号的重要下游分子，通过抑制Cdc42介导Slit2的抗迁移功能。但是，也有学者认为, Slit2/Robo1促进肠道肿瘤发生发展。Qian等[24]研究发现, Slit2/Robo1结合可以通过激活Src磷酸化，进而激活Wnt/β-连环蛋白信号(β-catenin)通路诱导上皮细胞向间质细胞的转变(EMT)继而促进肠道肿瘤发生。最新的研究[25]显示, Slit2还可能是遗传性结直肠癌(CRC)遗传易感性的潜在作用基因。

在消化系统肿瘤中，也已发现多种微小RNA(micro-RNA)通过Slit2/Robo1信号通路调控肿瘤细胞的发生发展。miR-1179在ESCC细胞中表达上调，通过抑制Slit2/Robo1通路增强ESCC细胞的侵袭能力[26]; 在胃癌细胞中, miR-218的表达与Slit2的甲基化呈负相关, miR-218通过作用于Robo1干扰Slit2/Robo1通路，从而破坏胃癌血管的行成，抑制肿瘤细胞生长[27]。

3.2 Slit2/Robo1与胰腺癌、肝癌

Katia等[10]从表观遗传学的角度研究了Slit2/Robo1在腺癌中的变化，在对167例胰腺导管腺癌组织行大规模的甲基化和表达谱分析后发现, Slit2与Robo1的CpG岛和启动子区域均出现超甲基化现象，从而导致Slit2-Robo1信号通路的表观遗传失活。JIANG等[28]建立了胰腺癌细胞系和高淋巴转移潜能的小鼠模型，并观察到胰腺癌细胞淋巴结转移型小鼠中Robo1较未出现淋巴结转移的小鼠表达下调。值得注意的是, Secq等[29]研究了肿瘤内微环境(基质)对PDAC进展的影响，发现癌相关成纤维细胞(CAF)分泌Slit2通过调节N-钙黏蛋白/β-catenin信号传导，促进背根神经节神经元以及施旺(Schwann) 细胞迁移与增殖，从而增加神经突的生长，抑制Slit2/Robo1信号传导则可破坏这种基质、神经连接，减少患者术后复发率和肿瘤后期疼痛感。Jin[30]等首先报道了肝癌细胞中(HCC)中存在Slit2的表观遗传学沉默，他们通过对54例原发性肝癌组织进行甲基化分析发现，由于Slit2的CpG岛高甲基化，使其表达较正常肝细胞下调。Mano等[31]通过体内外实验发现，抑制Slit2/Robo1表达可以促进肝癌细胞增殖和迁移，而过度表达Robo1与Slit2则可以显着抑制癌细胞增殖和迁移。Slit2/Robo1为肝癌的治疗提供一个新的可能治疗靶点。

4 Slit2/Robo1与妇科肿瘤

4.1 Slit2/Robo1与卵巢癌

RDONG等[32]研究发现，卵巢癌组织和卵巢癌患者血清样品中Slit2基因启动子出现异常甲基化状态，其中包括早期卵巢癌患者的血清样品。Hai等[33]也发现了上述现象，在将Slit2去甲基化恢复表达后，可以明显抑制卵巢癌细胞生长、迁移、集落形成能力并诱导肿瘤细胞凋亡。 这些结果表明Slit2是卵巢癌的肿瘤抑制因子，将来可能是卵巢癌治疗的新靶点。

4.2 Slit2/Robo1与子宫内膜癌、子宫颈癌

子宫内膜癌(EC)是常见的女性恶性疾病，约占女性肿瘤的7%, 是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，占生殖道恶性肿瘤的20%～30%[34]。目前的研究主要认为, Slit2/Robo1信号通路通过调控内膜癌组织中的微血管密度而影响子宫内膜癌的预后及复发。Shulan等[35]对比了45例子宫内膜癌复发患者与110例未复发患者的Slit2与Robo1的表达情况，发现Slit2和Robo1在复发组内膜癌中表达明显高于未复发组，且Slit2和Robo1 表达均与微血管密度(MVD)呈正相关。有趣的是，目前有学者[36]发现，一定浓度雌激素可以刺激子宫内膜癌细胞中的Slit2 mRNA的表达，而孕激素则会拮抗上述作用。Ratnesh KS等[37]通过微卫星分析发现，在宫颈癌组织样本中Slit2启动子超甲基化及Slit2缺失现象，经多因素分析显示Slit2缺失与其启动子甲基化存在显著相关性，可能在宫颈癌发展中起重要作用。Sraboni M等[38]通过对宫颈癌组织样本和宫颈癌细胞系进行表达谱分析发现，原发性宫颈癌中Slit2和Robo1的RNA和蛋白质表达均降低，认为Slit2/Robo1的表达水平与肿瘤的分期和预后有关, Slit2/Robo1表达越低则预示着肿瘤分期越高、预后越差。

5 Slit2/Robo1与其他肿瘤

5.1 Slit2/Robo1与乳腺癌

Slit2/Robo1在乳腺癌发生、发展及脑转移过程中发挥重要作用。Dallol等[39]发现乳腺癌患者组织中的Slit2基因启动子出现异常甲基化，从而下调了Slit2的表达。Feng等[40]通过评估118例浸润性导管癌(IDC), 44例导管原位癌(DCIS)和34例良性乳腺病变的Slit2和Robo1的免疫组织化学染色、mRNA表达水平发现, Slit2和Robo1低表达的浸润性导管癌患者预后较差，且较大概率出现脑特异性转移。Chang等[41]对乳腺癌细胞微环境研究发现，乳腺癌细胞的致癌潜力是由其Robo1受体及其间质成纤维细胞分泌的配体Slit2之间的相互作用决定的。活性Slit2/Robo1信号的存在能阻止β-catenin转移到细胞核中，继而通过磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径下调c-myc和细胞周期蛋白D1的表达。结合临床，乳腺癌细胞中的Robo1表达与乳腺癌患者生存期呈正相关，基质成纤维细胞中Slit2的低表达与淋巴结转移有关。根据目前研究提示Slit2/Robo1可能在抑制乳腺癌发生发展及脑转移过程中发挥重要作用。可能成为判断乳腺癌预后和脑转移的分子标志物，为乳腺癌的治疗提供新靶点。

5.2 Slit2/Robo1与肺癌

Slit2/Robo1在肺癌中的作用较为复杂。Yong-Jae等[42]对人肺鳞状细胞癌(SCC)组织与正常肺组织进行焦磷酸测序法分析发现，肺癌组织中Slit2启动子区域的出现高甲基化现象。Suzuki等[43]在非小细胞肺癌组织中也检测到类似现象。Li等[44]对非小细胞肺癌癌旁组织、肺癌组织、脑转移组织进行Robo1表达进行检测，发现Robo1的阳性表达率依次增高，且 Robo1在肺癌脑转移中的表达与肺癌脑转移患者的预后呈负相关。Wen等[45]进一步发现了泛素特异性蛋白酶33(USP33)可以调节肺癌细胞的Slit-Robo信号传导，在正常肺细胞中, Slit2结合Robo1并激活下游分子，调节肌动蛋白细胞骨架并抑制细胞迁移。 去泛素化酶USP33可减少Robo1的泛素化和降解，从而稳定Robo1蛋白。 然而，在肺癌细胞中，表达下调的USP33导致Robo1的泛素化和降解增加，从而干扰了Slit2/Robo1信号通路，进而促进肺癌细胞迁移。

6 小 结

Slit2/Robo1在不同肿瘤中机制不同，作用也不尽相同。Slit2/Robo1除了通过抑制或促进Wnt/β-catenin等经典的原癌通路来促进或抑制肿瘤的发生发展，也可以通过影响肿瘤血管密度、肿瘤微环境来影响肿瘤的增殖与转移。值得注意的是，在结直肠癌中，不同的学者发现了Slit2/Robo1两种相反的作用，这可能与Robo1的突变有关。Feng等[46]在体外实验中发现，在白血病细胞中过表达Robo1可以产生抗增殖和促凋亡作用，然而，这种作用在Robo1突变体中丧失。Robo1在结直肠癌或其他肿瘤中是否存在突变并引起相反的两种作用值得进一步研究。近年来，随着对microRNA的认识及研究深入，目前已发现多种miRNA通过作用于Slit2或Robo1从而影响肿瘤的进展。其中miR-218在胶质瘤、胃癌等多种肿瘤中均可以作用于Slit2/Robo1起到抑癌作用，这也为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。因此, Slit2/Robo1信号通路有可能成为多种肿瘤预防和治疗的潜在靶标。