芍药苷对慢性髓系白血病耐阿霉素细胞株K562/ADR多药耐药性的逆转作用及机制

朱聪，贾秀红，刘迎雪

(滨州医学院附属医院，山东滨州256603)

慢性髓系白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种起源于多能干细胞的血液系统肿瘤，其治疗以化疗为主。阿霉素(adriamycin，ADR)是CML的常用化疗药物，但多药耐药的发生，严重影响CML治疗效果及疗程[1～3]。多药耐药是影响CML化疗疗效的重要原因，寻找选择性多药耐药逆转剂已成为研究热点。根据美国食品药品监督管理局的统计，目前批准的抗肿瘤药中有25%～48%来自植物，因此，天然化合物被认为是抗肿瘤药物的潜在来源[4，5]。芍药苷是从白芍中提取的一种多酚类化合物，具有抗肿瘤作用。芍药苷可以通过抑制Notch-1信号通路而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭[6]，通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信号通路而抑制子宫内膜癌细胞增殖[7]，通过上调HTRA3表达而抑制胰腺癌细胞生长[8]，通过诱导MAPK家族蛋白ERK、JNK、p-38表达而诱导白血病Jurkat细胞的凋亡[9]。但芍药苷对白血病多药耐药的影响尚未有报道。2017年10月1日～2018年1月30日，我们观察了芍药苷对CML耐ADR细胞株K562/ADR多药耐药的逆转作用，并探讨其作用机制，为临床应用芍药苷辅助治疗白血病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品、细胞及试剂 芍药苷购自郑州卓峰制药有限公司，纯度>98%，溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配成100 μmol/L的原液，贮存于-20 ℃冰箱中，实验前用RPMI1640培养液稀释至目的浓度；ADR购自北京博奥森生物技术有限公司，用双蒸水配成2 mg/mL的溶液。K562细胞株、K562/ADR细胞株由滨州医学院肿瘤分子生物学实验室提供。DMSO购自美国Sigma公司；RPMI1640培养液购自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所；细胞裂解缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、PVDF膜购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人MRP1、p38、p-p38多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；GADPH多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 ADR对K562/ADR细胞、K562细胞的半抑制浓度(IC50)测算 采用CCK-8法检测。K562细胞培养于RPMI1640+10%胎牛血清培养液中，K562/ADR细胞培养于RPMI1640+10%胎牛血清+4 μg/mL的ADR培养液中，均置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的无菌培养箱中常规培养。实验前1周，K562/ADR细胞培养液更换为不含ADR的培养液。实验时取对数生长期K562细胞、K562/ADR细胞接种于96孔板，调整至每孔细胞数为5×103个。实验分为2组：K562细胞组(分别加入0、0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL的 ADR)、K562/ADR细胞组(分别加入0、16、32、64、128 μg/mL的ADR)。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养24 h，每个浓度设5个平行复孔，每孔加入10 μL 的CCK溶液，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，并计算ADR的IC50，K562/ADR细胞对ADR的耐药倍数=K562/ADR细胞组IC50/K562细胞组IC50。

1.3 芍药苷对K562/ADR细胞的细胞毒性测算 采用CCK-8法检测。将对数生长期K562/ADR细胞接种于96孔板，调整至每孔细胞数为5×103个。将K562/ADR细胞分为2组：空白对照组(加入等量DMSO)、实验组(分别加入2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的芍药苷100 μL)，均置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养24 h,用酶标仪测定各组吸光度值。K562/ADR细胞增殖抑制率=(1-实验组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。选择用于后续实验的芍药苷浓度应无明显细胞毒性，即细胞增殖抑制率<10%。

1.4 加入芍药苷后ADR对K562/ADR细胞的IC50测算 采用CCK-8法检测。将对数生长期K562/ADR细胞接种于96孔板，调整至每孔细胞数为4×105个。将K562/ADR细胞分为A、B、C三组，每组设5个复孔。A组分别加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR；B组分别加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR，然后加入2 μmol/L的芍药苷；C组分别加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR，然后加入4 μmol/L的芍药苷。三组均置无菌培养箱常规培养24 h，用酶标仪测定各组吸光度值，计算ADR的IC50。B、C组的逆转倍数=A组IC50/B组IC50或C组IC50。

1.5 加入芍药苷后K562/ADR细胞内ADR浓度变化观察 将对数生长期K562/ADR细胞接种于96孔板，调整至每孔细胞数为1×105个。将K562/ADR细胞分为a、b、c三组，a组加入3 μg/mL 的ADR；b组加入3 μg/mL 的ADR和2 μmol/L的芍药苷；c组加入3 μg/mL的 ADR和4 μmol/L的芍药苷。常规避光培养1 h，以750 g离心5 min，PBS洗涤去除游离ADR。流式细胞仪检测485/580 nm波长处ADR荧光强度，即细胞内ADR浓度。

1.6 加入芍药苷后K562/ADR细胞中多药耐药相关蛋白MRP1、MAPK信号通路蛋白p38和磷酸化p38(p-p38)检测 采用Western blotting法。将“1.5”中a、b、c三组的K562/ADR细胞置于不同离心管，离心后收集细胞，PBS洗涤，加入100 μL的蛋白裂解液，离心后提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测各受检蛋白浓度。配制8%的SDS-PAGE凝胶，每孔加入50 μg蛋白样品，将蛋白质电泳并反转至PVDF膜，5%脱脂牛奶+0.2% Tween20封闭2 h，与特异性抗体4 ℃孵育过夜。次日，室温下用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶5 000)密封PVDF膜2 h,暗室中分别显影、定影，将胶片用扫描仪扫描至电脑，并用Image J软件进行受检蛋白光密度值分析。受检蛋白相对表达量=受检蛋白光密度值/内参蛋白光密度值×100%。

2 结果

2.1 ADR对K562/ADR细胞、K562细胞的IC50比较 ADR对 K562/ADR细胞、K562细胞的IC50分别为(48.37±2.10)、(1.47±0.36)μg/mL，两者相比，P<0.05。K562/ADR细胞对ADR的耐药倍数为32.91倍。

2.2 芍药苷对K562/ADR细胞的细胞毒性比较 2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的芍药苷对K562/ADR细胞的增殖抑制率分别为2.67%±0.82%、9.20%±1.32%、18.94%±1.84%、30.62%±1.73%、44.13%±2.28%、61.38%±2.68%、74.68%±3.98%、85.39%±5.12%，两两相比，P均<0.05。芍药苷浓度为2、4 μmol/L时，对K562/ADR细胞无明显细胞毒性(细胞增殖抑制率小于10%)。

2.3 加入芍药苷后ADR对K562/ADR细胞的IC50比较 A、B、C组ADR对K562/ADR细胞的IC50分别为(29.97±1.72)、(20.03±0.75)、(13.78±0.63)μg/mL，两两相比，P均<0.05。B、C组对ADR的逆转倍数分别为1.51、2.17，逆转倍数与芍药苷的浓度呈正相关(r=0.43，P<0.05)。

2.4 加入芍药苷后K562/ADR细胞内ADR浓度变化 a、b、c组荧光强度分别为320±14、676±62、883±28，两两相比，P均<0.05。

2.5 加入芍药苷后K562/ADR细胞中MRP1、p38、p-p38蛋白的表达比较 a、b、c组中MRP1蛋白的相对表达量分别为87.69%±1.54%、80.95%±4.10%、67.72%±5.98%，两两相比，P均<0.05； p38蛋白的相对表达量分别为66.7%±1.22%、60.18%±2.78%、59.82%±4.02%，两两相比，P均>0.05；p-p38蛋白的相对表达量分别为72.43%±2.67%、63.18%±2.32%、52.23%±6.02%，两两相比，P均<0.05。

3 讨论

本实验首先观察了K562/ADR细胞对ADR的稳定耐药性，并检测了芍药苷对K562/ADR细胞的细胞毒性，按照细胞增殖抑制率<10%的标准，选择2 μmol/L、4 μmol/L浓度的芍药苷用于后续实验。实验结果显示，芍药苷在无毒剂量下可明显增强ADR对K562/ADR细胞的细胞毒性,且逆转效果与芍药苷的浓度呈正相关。同时，实验还检测了加入芍药苷后K562/ADR细胞内ADR浓度变化情况，结果显示，加入芍药苷后K562/ADR细胞内ADR浓度显著升高，说明芍药苷可通过增加K562/ADR细胞内ADR药物浓度起到逆转多药耐药的作用。

实验还对多药耐药相关蛋白MRP1、MAPK信号通路蛋白p38和p-p38蛋白的表达进行了检测，结果显示，加入芍药苷后K562/ADR细胞中MRP1、p-p38蛋白的表达水平显著下降。多药耐药相关蛋白MRP1蛋白属于ATP结合盒膜转运子家族成员，是化疗药物作用于肿瘤细胞的关键屏障。MRP1可阻止药物作用于靶细胞，从而降低肿瘤细胞的药物敏感性[10～12]。MRP1在多种肿瘤细胞中呈高表达，可导致化疗药物治疗失败[13，14]。本研究结果表明，与不含芍药苷组比，ADR与芍药苷联用组MRP1的表达明显降低，MRP1的表达下降增加了K562/ADR细胞内ADR的浓度。p38是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一员，具有多种生物活性，如促进细胞增殖、分化，促进炎症介质合成、释放等[15～18]。p38 MAPK信号通路活化标志为p-p38。研究[19，20]显示，p38 MAPK信号通路在CML的多药耐药产生中具有重要作用。同时，p38 MAPK信号通路可以调节MRP1的蛋白表达水平[21]。本研究结果表明，经芍药苷处理24 h后，p38蛋白表达水平未见明显改变，而p-p38表达水平明显降低，即p38活性降低，表明芍药苷通过p38 MAPK通路抑制MRP1蛋白表达。

综上，芍药苷能逆转K562/ADR细胞对ADR的耐药性，逆转作用与抑制P38 MAPK信号通路及下调MRP1蛋白表达有关。本研究为临床应用芍药苷治疗CML奠定了实验基础。