黄芩苷对多发性骨髓瘤细胞株U266增殖、凋亡、侵袭的影响

赵含笑，于天启

(广州中医药大学第三附属医院，广州510378)

多发性骨髓瘤是由于浆细胞恶性克隆，合成和分泌结构单一的单克隆免疫球蛋白(M蛋白)和(或)其轻链，并伴有正常免疫球蛋白减少的恶性肿瘤。糖皮质激素对淋巴细胞具有溶解作用，地塞米松可以通过多种通路诱导B淋巴细胞的凋亡。中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017版)推荐，无论初始治疗还是复发以及原发耐药多发性骨髓瘤，均首选包含地塞米松的化疗方案[3]。随着蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)、免疫调节剂(如来那度胺)的出现以及应用，多发性骨髓瘤患者的中位生存期有所提高。然而在现有的治疗方法下，大多数患者还是不可避免地进展为复发难治性多发性骨髓瘤[4]。Wnt通路与多发性骨髓瘤细胞的生长、发育、迁移有关，在多发性骨髓瘤细胞中被异常激活。Wnt通路被激活后，糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)活性受到抑制，使β-catenin在核内聚集，激活下游靶基因如c-Myc和cyclin D1，促进多发性骨髓瘤细胞增殖。研究[5]认为，影响β-catenin或GSK-3β的基因蛋白表达可能是多发性骨髓瘤治疗的新方法。多发性骨髓瘤属中医“骨痹”“骨蚀”“虚劳”等范畴，以脾虚亏虚、痰瘀湿毒为病机。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒之功效，黄芩苷是黄芩中的有效成分之一，具有抑制急性髓细胞白血病细胞的生长[6]、降低阿霉素耐药性[7]的作用。2018年3月31日～2018年8月31日，我们观察了不同浓度的黄芩苷对人多发性骨髓瘤细胞株U266增殖、凋亡、侵袭及β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂及仪器 人多发性骨髓瘤细胞株U266购自武汉普诺赛生命科技有限公司。黄芩苷(95%)、地塞米松(标准品)、BCA蛋白定量试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司，RPMI1640培养基、青-链霉素混合液(100×)、胎牛血清、PBS缓冲液购自Gibco公司，CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所，Annexin-V/PI双染试剂盒购自贝博生物，柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，cDNA kit购自Thermo Scientific公司，Fast SYBR Mixture(High ROX)购自康为世纪生物科技有限公司，脱脂奶粉购自美国BD公司，Anti-beta Catenin抗体、Anti-GSK3(alpha+beta)抗体购自Abcam公司。细胞培养箱、超净操作台购自上海力申科学仪器有限公司，流式细胞仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司

1.2 细胞分组及黄芩苷给予方法 ①黄芩苷对U266细胞半抑制浓度(IC50)的检测：U266细胞培养于含10% FBS的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2、潮湿空气的培养箱中培养。每2～3 d换液1次，待细胞生长至80%～95%融合时进行细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。收集对数期U266细胞，实验组分别用浓度为2、4、8、16、32 μmol/L黄芩苷培养基重悬细胞，对照组加入不含黄芩苷的培养基，分别接种于96孔板，调整为每孔细胞数5×104个，分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育1.5 h，酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度(OD)值，计算各浓度细胞增殖抑制率。通过Graph Pad Prism 6计算可得，24、48、72 h黄芩苷对U266细胞的IC50值分别为45.63、18.28、6.12 μmol/L，呈时间和浓度依赖性。取48 h的黄芩苷对U266细胞的IC50值18.28 μmol/L为最佳浓度，用于后续实验。②细胞分组及黄芩苷给予方法：将U266细胞分为4组，空白组加入不含药物的培养基、地塞米松组加入地塞米松、黄芩苷组加入黄芩苷、地塞米松+黄芩苷组加入地塞米松和黄芩苷，分别培养。

1.3 各组细胞增殖抑制率测算 各组细胞培养24、48 h时，采用CCK-8法检测各组OD值，以OD值反映各组细胞增殖抑制情况。

1.4 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法。各组细胞培养24 h时，用Annexin-V/PI双染试剂染色后流式细胞仪检测，调试电压和荧光补偿后，画十字门，记录各组十字门的第四象限细胞百分比，以第四象限细胞百分比表示各组细胞凋亡率。

1.5 各组细胞侵袭能力检测 采用Transwell 侵袭实验。各组细胞培养12 h时，结晶紫染色，光学显微镜下随机选取不同视野，计数结晶紫染色的穿膜细胞数，以穿膜细胞数表示各组细胞侵袭能力。

1.6 各组细胞β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1 mRNA检测 采用RT-PCR法。各组细胞培养48 h时，提取各组的总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，参照PCR 扩增试剂盒说明书配制PCR反应体系，以GAPDH为内参进行PCR扩增。引物序列：β-catenin上游引物为5′-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3′，下游引物为5′-CGAGTCATTGCATACTGTCCAT-3′；GSK3β上游引物为5′-AGACGCTCCCTGTGATTTATGT-3′，下游引物为5′-CCGATGGCAGATTCCAAAGG-3′；c-Myc上游引物为5′-GTCAAGAGGCGAACACACAAC-3′，下游引物为5′-TTGGACGGACAGGATGTATGC-3′；cyclin D1上游引物为5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游引物为5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；GAPDH上游引物为5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，下游引物为5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。PCR反应条件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72℃ 20 s，共进行40个循环。用2-△△Ct表示各组细胞中β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1的mRNA相对表达量。

1.7 各组细胞β-catenin、GSK3β蛋白检测 采用Western blotting法。各组细胞培养48 h时，分别提取细胞总蛋白，BCA检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为1 g/L，煮蛋白变性，取20 μL蛋白样品于电泳槽中电泳，电转蛋白至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入各蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入脱脂牛奶标记的二抗，室温孵育后洗涤3次，化学发光显色后，Image J软件计算各组细胞β-catenin、GSK3β蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞OD值比较 培养24 h时，空白组、地塞米松组、黄芩苷组、地塞米松+黄芩苷组的OD值分别为0.33±0.01、0.29±0.01、0.30±0.01、0.27±0.02，地塞米松+黄芩苷组与空白组相比，P<0.05；其余各组间相比，P均>0.05。培养48 h时，空白组、地塞米松组、黄芩苷组、地塞米松+黄芩苷组的OD值分别为0.57±0.02、0.42±0.02、0.49±0.01、0.36±0.02，组间相比，P均<0.05。

2.2 各组细胞凋亡率比较 培养24 h时，空白组、地塞米松组、黄芩苷组、地塞米松+黄芩苷组细胞凋亡率分别为5.4%、17.8%、13.8%、30.5%，黄芩苷组与地塞米松组相比，P>0.05；其余各组间相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞侵袭能力比较 培养12 h时，空白组、地塞米松组、黄芩苷组、地塞米松+黄芩苷组每个镜下穿膜细胞数分别为(99±8.19)、(88.33±6.11)、(87.67±2.08)、(32.67±3.5)个，黄芩苷组与地塞米松组相比，P>0.05；其余各组间相比，P均<0.05。

2.4 各组细胞β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达量比较 见表1。

表1 各组细胞β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与空白组相比，﹡P<0.05；与地塞米松组相比，﹟P<0.05；与黄芩苷组相比，△P<0.05。

3 讨论

溶骨性骨病变或骨质减少是多发性骨髓瘤的病理特征之一,近90%的多发性骨髓瘤患者会发生骨质溶解性骨病变，常伴有严重骨痛、病理性骨折、椎体塌陷、高钙血症、脊髓受压等与骨骼相关的事件。溶骨性骨病变是破骨细胞激活和成骨细胞抑制的结果，打破了破骨细胞和成骨细胞在正常组织中形成的平衡状态，导致骨重塑改变。在多发性骨髓瘤中，破骨细胞数量和活性增加，而成骨细胞分化的负调控因子抑制骨形成。因此，以成骨细胞、破骨细胞为靶点的新型药物不仅是治疗多发性骨髓瘤溶骨性病变的一种很有研究价值的治疗策略，也是治疗多发性骨髓瘤的一种颇具前途的治疗新策略[8]。研究[9]显示，黄芩苷在低浓度(低于1 μmol/L)下可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化成熟、增强破骨细胞分化和骨吸收，而在高浓度(高于2 μmol/L)时对破骨细胞有抑制作用。本研究结果显示，黄芩苷可抑制U266细胞的增殖；黄芩苷能够诱导U266细胞的凋亡，并增加地塞米松对细胞凋亡的诱导；经黄芩苷干预后下室穿膜细胞数减少，作用效果与地塞米松类似。

Wnt 信号通路在组织和器官的稳态维持和修复方面至关重要，与多种肿瘤有关，同时对骨形成和骨重建有重要作用。有研究[10]表明，黄芩苷可促进成骨细胞的增殖和分化，抑制破骨细胞的活性。黄芩苷可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化成熟，提高β-catenin、GSK-3β的mRNA水平,并提高β-catenin蛋白表达量。黄芩苷可显著增加成骨细胞的成骨矿化和编码骨分化标志物的mRNA水平,通过激活Wnt通路促进成骨细胞分化,激活GSK3β，进而诱导β-catenin的核积累，激活下游靶向基因转录，并可间接调控破骨细胞的活化。综上所述，黄芩苷可通过调节Wnt通路调控成骨细胞和破骨细胞的增殖分化，治疗和预防溶骨性骨病变及骨质疏松，从而达到间接治疗多发性骨髓瘤的目的。但目前尚未证实黄芩苷可以直接作用于多发性骨髓瘤细胞，抑制细胞的增殖、侵袭，促进细胞凋亡。本研究发现，黄芩苷和地塞米松均可下调Wnt通路调节分子β-catenin、GSK3β及下游靶基因c-Myc、cyclin D1 mRNA的表达；黄芩苷和地塞米松联合应用时，可下调β-catenin、GSK3β蛋白表达量，但黄芩苷、地塞米松单独应用时则不能。

目前认为，β-caetnin是Wnt信号传导通路的正向调节因子，而GSK3β是负向调节因子[11]。但本实验结果显示，黄芩苷干预多发性骨髓瘤U266细胞后，β-caetnin和GSK3β mRNA的表达均下调，黄芩苷和地塞米松联合应用时，也可下调β-catenin、GSK3β蛋白表达量，与其他研究结论不完全相符。目前尚缺乏血液系统疾病尤其是多发性骨髓瘤各细胞系经Wnt通路抑制剂或中药单体干预后对Wnt通路中β-catenin、GSK3β的mRNA及蛋白表达的影响的研究，尚需接下来进一步实验的证实。另外，是否由于黄芩苷对多发性骨髓瘤U266细胞Wnt经典通路起到双向调节作用，使其在诱导凋亡过程中β-catenin、GSK3β的mRNA及蛋白表达均下调亦需要进一步探索。

综上所述，黄芩苷可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、侵袭，促进其凋亡，作用效果与地塞米松类似，黄岑苷与地塞米松联用时有协同作用。黄岑苷与地塞米松联用时，可下调Wnt通路调节分子β-catenin、GSK3β及下游靶基因c-Myc、cyclin D1 mRNA的表达，还可下调β-catenin、GSK3β蛋白表达量。黄芩苷与地塞米松可能通过Wnt通路及其下游因子调控多发性骨髓瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。