肝细胞癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员的表达观察

陈清梅，陈睿，邓阳

(1 山东大学第二医院，济南250033；2 山东省医学科学院放射医学研究所；3 泰山医学院公共卫生学院)

原发性肝癌居我国常见恶性肿瘤的第4位和肿瘤死亡原因的第2位，2015年我国肝癌新发病例和死亡病例分别约为46.6万和42.2万[1]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要组织类型，占70%～85%，而我国85%以上的HCC主要由HBV慢性感染所致[2]。HBV慢性感染导致慢性活动性炎症，促使炎症因子激活载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3，APOBEC3s)类胞苷脱氨酶。APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族有7位成员，包括APOBEC3A(简写为A3A，下同)、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G和A3H。APOBEC3s类胞苷脱氨酶具有脱氨基活性，机体感染HBV后，APOBEC3s类胞苷脱氨酶通过诱导大量胞嘧啶转化为尿嘧啶启动不同的抗病毒机制，包括抑制HBV表面蛋白编码区启动子表达、降解前基因组RNA以及阻碍病毒基因组核衣壳化等多个步骤，可有效抑制HBV复制[3]。但是，APOBEC3s类胞苷脱氨酶的编辑作用也促进了病毒和宿主基因组变异，造成HBV基因变异/缺失频率增加，尤其是HBV-C基因型的X基因(HBx)变异，促进HCC的发生发展。本研究观察了HCC患者癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA及蛋白的表达情况，分析APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA表达水平与HCC患者预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008～2014年在泰山医学院附属医院接受根治性肝切除术的HBV感染HCC患者155例，男121例、女34例，年龄(55.14±11.62)岁。手术中留取患者癌组织和癌旁组织(距癌组织边缘>5 cm)，癌组织经病理组织学检查证实为HCC，且切缘未见癌细胞。所有患者在术前未接受化疗、放疗等其他治疗。本研究获得患者或患者家属知情同意，并经过泰山医学院医学伦理委员会同意和批准。

1.2 受检组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA的检测 TRIzol试剂抽提癌组织和癌旁组织中的RNA，逆转录试剂盒对APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H进行逆转录，以GAPDH为内参，SYBR Green I法进行实时定量PCR检测。反应条件为95 ℃预变性30 s，40个循环(95 ℃变性15 s、按各基因退火温度退火15 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸10 min。用2-△△Ct表示受检组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶家族成员mRNA的相对表达量。A3A正、反向引物分别为5′-ATAGAATTCATGGAAGCCAGCCCAGC-3′和5′-ATATCTCGAGTCAGTTCCCTGATTCT-3′，A3B正、反向引物分别为5′-CGCCAGACCTACTTGTGCTAT-3′和5′-CATTTGCAGCGCCTCCTTAT-3′，A3C正、反向引物分别为5′-TCCTAACACAAAGTACCAGGTC-3′和5′-GATACTGGAAGTAGTAGAGGCG-3′，A3D正、反向引物分别为5′-ACGTCAGTCGAATCACAGGCAG-3′和5′-CTGGTCTCCTGGCTGTCAGTTG-3′，A3F正、反向引物分别为5′-CACGCTAAAGGAGATTCTCAGA-3′和5′-CATAGGCTTTGCGTAGGTTTTT-3′，A3G正、反向引物分别为5′-ATTCTCAGACACTCGATGGATC-3′和5′-CCACCTCATAACACAGGTAAGT-3′，A3H正、反向引物分别为5′-GGGGCAAGTCTGCTAAGGAA-3′和5′-CGGCGCTTGTTGTTAAACTG-3′，GAPDH基因正、反向引物分别为5′-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′和5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′。以癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA相对表达量的中位数为界，将155例HCC患者分为高表达组和低表达组，并分析APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族各成员mRNA相对表达量与HCC预后的关系。

1.3 受检组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员蛋白的检测 受检组织石蜡包埋、4 μm连续切片、脱蜡、水化，3% H2O2溶液室温孵育10 min，微波15 min修复抗原。加入鼠抗人APOBEC3s单克隆抗体(Abnova公司)，调整浓度至10 μg/mL，37 ℃孵育过夜。加入生物素标记的二抗及辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。以细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，随机选取5个高倍镜(×400)视野计算阳性细胞数，得出阳性细胞百分率。阳性细胞百分率低于25%计0分，26%～50%计1分，51%～75%计2分，75%以上计3分。根据阳性细胞的染色强度评分：无显色计0分，浅棕黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。上述两者得分相加，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)，阳性表达率=(+～+++)例数/总例数×100%。

2 结果

2.1 HCC患者癌组织和癌旁组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA相对表达量比较 HCC患者癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H mRNA相对表达量分别为4.08±0.11、6.61±0.17、6.42±0.10、5.29±0.12、6.64±0.12、7.49±0.07、4.32±0.08，HCC患者癌旁组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H mRNA相对表达量分别为2.93±0.11、4.60±0.11、5.48±0.11、5.22±0.08、6.97±0.08、5.91±0.12、4.21±0.10，癌组织与癌旁组织中A3A、A3B、A3C、A3G mRNA相对表达量相比，P均<0.05。

2.2 HCC患者癌组织和癌旁组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员蛋白阳性表达率比较 HCC患者癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H蛋白阳性表达率分别为92.3%、96.8%、89.0%、58.1%、69.7%、85.9%、52.9%，HCC患者癌旁组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H蛋白阳性表达率分别为61.3%、63.2%、57.4%、61.9%、74.8%、47.7%、47.7%，癌组织与癌旁组织中A3A、A3B、A3C、A3G蛋白阳性表达率相比，P均<0.05。

2.3 HCC患者癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA相对表达量与HCC患者预后的关系 155例HCC患者通过门诊复查和电话访问进行术后随访，以患者出院日期作为观察起点，以因HCC死亡日期作为观察终点，随访结束时间为2017年12月31日。随访内容为患者生存状况、复发状况以及肝功能检查。155例HCC患者中，A3A mRNA低表达者103例、高表达者52例，其5年生存率分别为27.3%、17.7%，两者相比，P<0.05；A3B mRNA低表达者108例、高表达者47例，其5 年生存率分别为30.0%、17.1%，两者相比，P<0.05；A3C mRNA低表达者64例、高表达者91例，其5 年生存率分别为31.5%、32.4%，两者相比，P>0.05；A3G mRNA低表达者58例、高表达者97例，其5 年生存率分别为33.6%、13.7%，两者相比，P<0.05。

3 讨论

APOBEC3s类胞苷脱氨酶在正常肝组织中只有微量表达，但在HBV感染后，其表达水平显著升高[4]。文献[5]报道，APOBEC3s类胞苷脱氨酶的核酸编辑作用是目前已知分布最广的促癌基因组变异机制。HBV变异和体细胞变异是HCC发生的标志性分子事件，而炎症通过诱导APOBEC3s类胞苷脱氨酶表达，促进病毒和宿主基因组变异，因此可认为APOBEC3s类胞苷脱氨酶是HBV促进HCC发生过程中的关键分子[3, 6]。APOBEC3s类胞苷脱氨酶在清除HBV的同时，其基因家族成员如A3B、A3C可显著促进HBV病毒变异，特别是羧基端截短型HBx(Carboxyl-Terminal Truncated HBx，Ct-HBx)变异可更加显著地促进HCC发生[7]。APOBEC3s类胞苷脱氨酶诱导人基因组发生特征性变异(在TCA或TCT序列中用T或G替代C)是癌症中的常见现象。APOBEC3s类胞苷脱氨酶的脱氨基作用通常以单链DNA为底物，但Mussil等[8]发现A3A可在细胞核内造成以胞苷高度突变和DNA双链断裂为主要形式的DNA损伤。本研究结果显示，与癌旁组织相比，A3A、A3B、A3C、A3G mRNA和蛋白表达水平在HCC癌组织中显著上调，提示APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族部分成员的异常表达可能是乙肝恶性转化的原因之一，属于HCC发生过程中的重要事件。

APOBEC3s类胞苷脱氨酶过表达可通过脱氨酶依赖性方式激活损伤反应从而诱导DNA断裂和致癌蛋白突变体产生。APOBEC3s类胞苷脱氨酶编辑的单碱基替换变异的数量与癌组织和癌细胞中A3A和A3B mRNA表达水平呈正相关，可见A3A和A3B是APOBEC3s类胞苷脱氨酶家族中负责编辑APOBECs特征性变异的主要成员[9]。研究[10]显示，乳腺癌组织中A3A和A3B表达水平显著高于正常组织，且与乳腺癌中胞嘧啶突变的程度相关。A3B可直接提高细胞集落形成能力并促进肝细胞生长，HCC癌组织中A3B上调热激转录因子1(heat shock transcription factor-1，HSF-1)表达，而HSF-1是一种由热休克蛋白诱导的反式激活因子，可影响肿瘤发生发展[7]。A3G是APOBEC3s类胞苷脱氨酶中较为活跃的脱氨酶，对体内的HBV DNA复制和编辑具有较强的抑制作用[3,11]。A3G在人体组织中广泛表达，其中肝脏组织A3G mRNA含量最高[12]。研究[13]表明，A3G能够促进原位结直肠癌小鼠模型发生肝转移在癌组织中如结直肠癌肝转移标本中A3G蛋白高表达。另外，原发高级别浆液性卵巢癌组织中A3G表达和T细胞浸润正相关[14]。与A3G相比，A3C抑制HBV复制的作用较弱，但在HepG2和Huh7细胞系中A3C可诱发高频率的HBV DNA突变，表明A3C最有可能在肝细胞中产生数量最显著的HBV突变，进而促进HCC发生[15]。

前期研究[16～18]发现APOBEC3s类胞苷脱氨酶表达异常与多种癌症包括乳腺癌、肾癌、肝细胞癌等预后不良相关。本研究进一步分析A3A、A3B、A3C和A3G mRNA表达对患者预后的影响，发现A3A、A3B和A3G mRNA高表达者5年生存率较低表达者低，预后差。Yang等[18]发现A3G与HCC患者总体生存率呈负相关，这与本研究一致，可能与癌组织中A3G异常升高导致脉管浸润、肝内转移和甲胎蛋白上升有关。

综上所述，APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3G mRNA和蛋白表达水平在HCC癌组织中显著上调，且A3A、A3B、A3G mRNA高表达的HCC患者术后生存率低。APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族部分成员异常表达可能与HCC发生密切相关，观察HCC患者癌组织中A3A、A3B、A3G mRNA的表达水平，可为预测和评估HCC术后发展及转归提供参考。