AMP脱氨酶的生化性质研究

叶 炜，田吕明，姚 鹃，赵 劼，杨海珍，吕育财，肖 贝，龚大春，*

（1.三峡大学-艾能麦克德尔米德再生能源实验室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443002）

AMP脱氨酶的生化性质研究

叶 炜1，田吕明1，姚 鹃2，赵 劼2，杨海珍2，吕育财1，肖 贝1，龚大春1，*

（1.三峡大学-艾能麦克德尔米德再生能源实验室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443002）

主要从底物浓度、温度、pH和常见离子等方面对相对分子量56ku左右的腺苷酸脱氨酶的催化作用的影响因素进行研究。通过酶的催化实验，结果表明：原始底物质量浓度为2.78×10-2g/L、温度为37℃、pH为5.9时，AMP脱氨酶催化活性最好，IMP的转化速度最高为1.965×10-2mol/min。同时考察了Cu2+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Na+、Mg2+、Zn2+等阳离子和SO42-、Cl-、NO3-、CO32-、H2PO4-、B4O72-、柠檬酸根、EDTA离子等阴离子对AMP脱氨酶催化能力的影响。结果表明：柠檬酸根离子和Mn2+对AMP脱氨酶有明显激活性影响，其他离子浓度超过0.01mol/L时对AMP脱氨酶一般有抑制性影响，AMP脱氨酶商品酶在常温干燥状态下稳定性很好，4℃存放的酶液半衰期为5.5d。

AMP脱氨酶，酶活，生化性质

腺苷酸脱氨酶（AMP deaminase，EC 3.5.4.6）最早由鼠骨骼肌（Conway，1939）随后又由人红血细胞（Chaney，1962）制备，目前工业中通过培养酵母、青霉、曲霉和毛霉发酵产AMP脱氨酶[1]。脱氨酶是构成嘌呤核苷酸代谢循环的三种主要酶类之一，通过凝胶过滤测定相对分子量为48000±2000，通过SDSPAGE测定时相对分子量为60000±3000，属于疏基酶，每分子含2个活性疏基，其活性能对氯汞甲酸完全抑制，能催化腺嘌呤核苷转变为次黄嘌呤核苷，再经核苷磷酸化酶作用生成次黄嘌呤，其代谢缓和终末产物为尿酸[2]。AMP脱氨酶是一种氨基水解酶，它能够定量脱去腺苷酸嘌呤碱基上的氨基，生成IMP和NH3[3]，在食品添加剂上，脱氨酶最大用途是酶解腺苷酸生成IMP用于生产强力味精，它还是核酸酶解法生产呈味核苷酸的重要酶类之一，在酵母提取物的制备中，一般用核酸酶和AMP脱氨酶来增强味道[4]。其他产业上，脱氨酶用于生产细胞的H+缓冲剂。目前，国内外对AMP脱氨酶性质的研究，只有刘军昌[5]对来源于米曲霉的脱氨酶pH、热稳定性研究，发现在30℃和pH6的时候酶稳定性较好。Kazuki yoshimune[4]发现来源于烟曲霉的脱氨酶相对分子量为88ku，最适反应温度为50℃左右及pH为6时酶活力最高，也考察了金属离子的影响。本文用已知AMP脱氨酶酶活的商品酶进行脱氨酶生化特性的研究，深入了解AMP脱氨酶的催化性质，有利于高核酸酵母的进一步发展，为增加酵母提取物IMP含量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

5’-AMP 上海楷洋生物技术有限公司；腺苷酸脱氨酶商品酶（酶活为16000u/g） 安琪公司提供；其他试剂 均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活测定[5]液态酶酶活测定：移取3mL反应底物（3.475×10-2g/L）在37℃温度下保温5min，加入稀释后的AMP脱氨酶溶液0.1mL，立刻计时反应，反应15min后加入3mL 10%的高氯酸溶液终止反应。

对照样品方法同上，反应底物保温后用冰水预冷，加入3mL10%的高氯酸溶液终止反应，再加入0.1mL的样品。反应结束后，在265nm处，用石英比色皿，以水为参比测量吸光度。

酶活定义：在上述条件下每分钟吸光值改变0.001，定义为酶的活力单位。

测定固态酶酶活时称取m（g）固态酶，溶解在1mL溶液中，然后按照上述方法测定。两种不同状态酶的酶活计算公式如下：

液体酶活（u/mL）=（△A265×10×K）/（0.001×T）

固体酶酶活（u/g）=（△A265×10×K）/（0.001×T×m）

式中：△A265为空白对照与反应液吸光度的差值；K为酶液稀释倍数；T为酶的反应时间（min）；m为固态酶的质量（g）。

1.2.2 酶纯度及分子量验证实验 SDS-聚丙烯酰胺电泳，分离胶为12.5%，浓缩胶5%，pH8.3 Tris-甘氨酸电泳缓冲液，加样量为20μL，电泳1.5～2h查看公司提供固态酶纯度及具体分子量。

1.2.3 酶学性质实验

1.2.3.1 底物质量浓度对反应速度的影响 准确称取139mg腺苷酸，用0.08mol/L的NaHCO3溶液定容至10mL，即13.9g/L作为原始底物质量浓度。把原始底物质量浓度稀释400～1000倍数，配制成3.475×10-2、2.78×10-2、2.317×10-2、1.986×10-2、1.738×10-2、1.544× 10-2g/L不同的质量浓度梯度，在pH为6.0时，与质量浓度0.01g/mL的酶在37℃反应15min，测定△A265，计算反应速度。

1.2.3.2 酶质量浓度对反应速度的影响 配制0.008～0.025g/mL的质量浓度范围的商品酶，在底物浓度为3.475×10-2g/L，pH为6.0，37℃条件下反应15min，测定△A265，计算反应速度。

1.2.3.3 腺苷酸脱氨酶的最适反应温度实验 在27～62℃温度范围内，添加0.01g/mL的酶，在底物浓度为3.475×10-2g/L，pH为6.0条件下反应15min，测定△A265，计算反应速度。

1.2.3.4 腺苷酸脱氨酶的最适反应pH实验 在pH为4.5～7.5范围内，添加0.01g/mL的酶，在底物浓度为3.475×10-2g/L，37℃条件下反应15min，测定△A265，计算反应速度。

1.2.3.5 阴、阳离子对腺苷酸脱氨酶活性的影响 在0.001～0.1mol/L范围内，配制不同离子梯度溶液，添加到脱氨酶反应体系中，在底物浓度为3.475×10-2g/L，pH为6.0，37℃条件，反应15min，测定相对酶活。考察阳离子的影响时，阴离子均为硫酸根离子，主要有Cu2+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Na+、Mg2+、Zn2+，浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L五个梯度溶液；考察阴离子的影响时，阳离子均为对酶活无影响的钠离子，主要有SO42-、Cl-、NO3-、CO32-、H2PO4-、B4O72-、柠檬酸根、EDTA离子，浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L五个梯度溶液。

1.2.3.6 腺苷酸脱氨酶的稳定性研究 固态稳定性：将商品酶在常温干燥状态下存放，每周测一次酶活，经过三个月比较相对酶活。酶液稳定性：配制0.01g/mL酶液10mL，在4℃下存放每隔24h，测定酶活，比较相对酶活，考察酶的稳定性。

2 结果与分析

2.1 腺苷酸脱氨酶的鉴定、纯度及相对分子量的检测

采用不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶体积分数为12.5%，浓缩胶为5%，当溴酚兰达凝胶下部2/3时（约2h）终止电泳。用考马斯亮蓝G-250染液染色3h，经脱色液过夜洗脱，用紫外拍照成像如图1所示。商品酶一共由4种蛋白组成，相对分子量从大到小分别为56、35、33、27ku，其中56ku的酶浓度较高。经过与专利[6]所阐述的酶的相对分子量57ku相对照和AMP脱氨酶酶活实验，确定商品酶主要为AMP脱氨酶。该商品酶可以用于酶学生化性质的研究。

图1 AMP脱氨酶的商品酶SDS-PAGE电泳图Fig.1 The AMP deaminase enzyme products by SDS-PAGE map

2.2 底物质量浓度的影响

按照1.2.3.1的方法实验，结果如图2所示。由图可知，在底物质量浓度为2.317×10-2g/L以下，酶催化反应速度与底物质量浓度趋近正比关系，反应速度随着底物质量浓度的增加而增加；当底物质量浓度在2.317×10-2～2.78×10-2g/L时，反应速度上升并趋于稳定。在底物质量浓度为2.78×10-2g/L时反应速度达到最大，即为1.965×10-2mol/min；当底物质量浓度继续增加时反应速度下降，底物质量浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。说明底物浓度过高对脱氨酶的催化作用有一定抑制作用。

2.3 酶质量浓度的影响

按照1.2.3.2的方法实验，结果如图3所示。由图可知，酶的质量浓度在小于0.013g/mL范围内递增时，酶催化反应速度与酶质量浓度趋近成正比关系。当酶质量浓度超过0.013g/mL，酶催化速度随浓度的增加而下降。脱氨酶反应产物NH3和IMP对酶有竞争性抑制作用[5]，产物随着酶质量浓度的增加而增加，对酶的抑制作用加强，从而降低酶的反应速度。

图3 酶质量浓度对反应速度的影响Fig.3 Effect of enzyme concentration on reaction speed

2.4 温度的影响

按照1.2.3.3的方法实验，结果如图4所示。由图可知，在27～37℃之间，随着温度的上升，酶的反应速度急剧上升，在37℃时，反应速度到达最高为1.965× 10-2mol/min。随温度继续上升，反应速度急剧下降，但当温度上升到42℃时下降幅度变小，当温度超过52℃时，反应速度又开始快速下降。在其他条件相同的情况下，温度每升高10℃，化学反应速度增加将近一倍，当温度升高到37℃时，反应速度达到最大。随温度继续上升酶开始变性失活，反应速度快速下降，当温度上升到42℃，产物NH3游离态减少，降低对脱氨酶的抑制，反应速度下降幅度平缓，但当温度超过52℃，腺苷酸脱氨酶严重变性失活，反应速度又快速下降。为保证酶的有效利用，反应温度应该控制为37℃。

图4 温度对反应速度的影响Fig.4 Effect of temperature on reaction speed

2.5 pH对腺苷酸脱氨酶反应速度的影响

按照1.2.3.4的方法实验，结果如图5所示。由图可知在pH为6以内，反应速度随pH的增加而增加，在pH为5.9时，反应速度达到最大值，当pH超过6以后，反应速度随pH的增加而下降。因此酶的最适pH为5.9左右，最适pH=（pK1+pK2）/2=（5.2+6.7）/2=5.95，基本上符合酶的最适pH。脱氨酶也是一种蛋白质，构成蛋白质的氨基酸含有碱性、中性、酸性基团。在一定的pH范围内，酶既带有正电荷基团也带有负电荷基团，而这些基团是构成酶活性点的部分。一种酶只能在一种特定的电荷状况下才具有催化活性。AMP脱氨酶也是这样的，随着pH的变化，具有这种特定电荷状况的酶只占总酶的一部分，酶的反应速度有个最大值，在最适pH条件下，酶反应速度达到最大。在pH5.5～6.5时，酶相对稳定，酶活在70%以上。

图5 pH对AMP脱氨酶的影响Fig.5 Effect of pH on AMP deaminase

2.6 阳离子对AMP脱氨酶活性的影响

按照1.2.3.5阳离子考察方案进行实验，结果见图6。由图可知，Cu2+在0.001mol/L对酶活有促进作用，但当浓度上升到0.005mol/L，开始对酶有抑制作用。Mn2+在0.001～0.1mol/L对酶都有促进作用。Al3+在0.01mol/L以内对酶活没有影响，而超过这个浓度对酶有强烈的抑制作用。Na+对酶活基本上没有影响，其他离子在0.01mol/L以内对酶活影响不大，当浓度超过0.01mol/L，对酶活都有一定的抑制作用。

图6 阳离子对AMP脱氨酶酶活的影响Fig.6 Effect of some cations on AMP deaminase

2.7 阴离子对AMP脱氨酶活性的影响

按照1.2.3.5阴离子考察方案进行实验，结果见图7。由图可知，柠檬酸-对AMP脱氨酶有明显激活性影响，CO32-、EDTA-在0.01mol/L内对酶活有促进作用，而浓度的上升对酶活开始有抑制作用。SO42-对酶活显著影响，Cl-、NO3-、H2PO4-和B4O72-都对酶活有抑制作用，浓度超过0.01mol/L时抑制作用比较强烈。

图7 阴离子对AMP脱氨酶酶活的影响Fig.7 Effect of anion on AMP deaminase

2.8 AMP脱氨酶的稳定性研究

2.8.1 固态稳定性 按照1.2.3.6方案实验，结果如图8。由图可知，由于脱氨酶很容易吸潮，商品酶在常温干燥下存放3个月，相对酶活保持在90%以上，在这段时间无法通过半衰期或者90%递减时间考察酶的稳定性情况。只能肯定AMP脱氨酶商品酶在常温干燥情况下有很好的稳定性。AMP脱氨酶具有极易吸潮性，吸潮后有氧气和水分，使疏基易被氧化，因而降低酶活。在常温干燥条件下就能保证AMP脱氨酶酶活的稳定。

图8 存放时间对干燥商品酶酶活的影响Fig.8 Effect of dry goods storage time on the activity of the enzyme

图9 4℃下的酶液存放时间对酶活的影响Fig.9 Effect of 4℃storage time on enzyme activity

2.8.2 液态稳定性 按照1.2.3.6方案实验，结果如图9。由图可知，酶液在4℃下保存，相对酶活随着时间的延长而下降，从第4d开始酶活急剧下降，到第7d酶活下降趋于平衡。由于AMP脱氨酶也是一种蛋白质，可能因为水分子会引起酶分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用、还可能会引起天冬氨酸肽键的水解、半胱氨酸的氧化、二硫键的破坏等，所以，酶分子在水溶液中随时间的延长酶活力下降。当到第7d时可能是由于酶变性接近完成，变性酶的含量大于未变性酶的含量很多，相对酶活下降趋于稳定。由图9中还可以看出，在4℃下AMP脱氨酶的半衰期为5.5d。

3 结论

随着5’-AMP脱氨酶的研究与开发，AMP脱氨酶被广泛应用于食品，医学以及其他领域。本研究以AMP脱氨酶商品酶（酶活为16000u/g）为研究对象，采用SDS-PAGE电泳测得AMP脱氨酶的相对分子量约为56ku。结果表明：原始底物质量浓度为2.78×10-2g/L、反应温度为37℃、pH为5.9时，AMP脱氨酶催化活性最好，IMP的转化速度最高为1.965×10-2mol/min。不同离子对AMP脱氨酶酶活会产生不同的影响，研究表明：柠檬酸根离子和Mn2+对AMP脱氨酶都有激活性，当激活剂的浓度低于0.05mol/L时，对脱氨酶有更强激活作用。不同浓度的Na+、SO42-对脱氨酶无明显影响，其他离子浓度超过0.01mol/L对AMP脱氨酶一般都有抑制性影响。AMP脱氨酶商品酶在常温干燥状态下的稳定性很好，4℃下酶液的半衰期为5.5d。为高核酸酵母抽提物的发展提供科学依据。

[1]普为民，丁骅孙，陶元器.5’-腺苷酸脱氨酶产生菌选育及发酵生态学研究[J].云南大学学报，1994，16（2）：184-188.

[2]黄仙娥.腺苷脱氨酶活性测定对胸水性质的鉴别作用[J].临床肺科杂志，2008，13（1）：95.

[3]David J Merkler，Anupam S Wali.AMP deaminase from yeast [J].J Biol Chem，1989，35：21422-21430.

[4]KazuakiYoshimune，Kugimiya，MitsuakiMoriguchi.Purification and characterization of a flavour-enhancing enzyme，thermostable adenosine-phosphate deaminase，from thermophilie Asperillus fumigatus NO 4[J].Annals of Microbiology，55（4）：267-272.

[5]刘军昌，段作营，毛忠贵.AMP脱氨酶活性测定的一种改进方法[J].食品与发酵工业，2001，27（7）：30-33.

[6]天野酶株式会社.放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用[P]. CN 1950501A，2007-04.

Study on the biochemical characteristics of AMP deaminase

YE Wei1，TIAN Lv-ming1，YAO Juan2，ZHAO Jie2，YANG Hai-zhen2，LV Yu-cai1，XIAO Bei1，GONG Da-chun1，*
（1.Alan G.Macdiamid Institute of Renewable Energy，China Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Angel Yeast Co.Ltd.，Yichang 443002，China）

The effects of the substrate concentration，temperature，pH value，and the other common ion on the catalytic action of Adenosine Deaminase with about 56ku molecular weight were studied.The best catalytic conditions such as the substrate concentration 2.78×10-2g/L，temperature 37℃，and pH value 5.9 were obtained，which the highest catalytic conversion rate was 1.965×10-2mol/min.Meanwhile，Cu2+，Fe2+，Al3+，Mn2+，Na+，Mg2+，Zn2+and SO42-，Cl-，NO3-，CO32-，H2PO4-，B4O72-，lemon acid radical，EDTA ion were found having a certain influence to the AMP deaminase.The result showed that lemon acid radical ion and Mn2+had an obviously activated influence on AMP deaminase，but the other ion concentration surpass 0.01mol/L generally had an inhibitory effect on AMP deaminase and the AMP deaminase powder had a good stability quality under atmospheric temperature in dry condition and the half-life of enzyme solution was 5.5 days at 4℃.

AMP deaminase；enzymatic activity；biochemical characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0164-04

2010－11－30 *通讯联系人

叶炜（1985-），男，硕士在读，研究方向：生物催化与转化。

三峡大学2010年研究生创新基金项目（2010CX099）。