实时荧光定量PCR技术在类风湿关节炎检测中的应用概况

苏 杉，王 蓉，赵 敏，高慧琴

（甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州730000）

类风湿关节炎（RA）是一种以关节病变为主要症状的慢性、全身性自身免疫病。其不仅侵犯关节滑膜、软骨、韧带和肌肉，还可能影响心、肺等脏器功能［1］，主要临床症状表现为局部关节疼痛、肿胀、晨僵、关节软骨破坏、贫血等［2］。RA的病因尚未明确，缺乏根本的药物治疗，目前治疗该病的理想效果是抑制炎症发展，预防骨质侵蚀或关节破坏，最大程度地改善患者的生活质量。研究证明，RA患者的关节滑膜在发病3个月之内可能出现破坏，一旦出现破坏便很难逆转，所以早期诊断及治疗对于控制病情的发展、降低致残率尤为重要［3］。临床目前主要靠症状表现、影像和血清类风湿因子（RF）水平诊断RA。而早期的症状表现常不典型，关节软骨有一定程度的破坏时影像才能发现，且RF在RA早期可能不出现，因此缺乏特异性［4］。因此，提高RA的早期诊断能力是目前面临的重要难题。聚合酶链反应（PCR）技术可定性检测病原体，有较高的灵敏度，但却无法实现病原体的定量检测。而高灵敏性和特异性的实时荧光定量PCR技术可以实现细胞因子mRNA表达谱的准确定量，可以用于解释炎症反应、自身免疫疾病中的免疫致病途径，即便待测样本中细胞因子含量极低［5］。因此，该技术在疾病诊断与疗效监控中的应用在逐步推广。现就实时荧光定量PCR技术在RA检测中的应用进行综述。

1 血液检测

有研究发现，miRNA在冠状动脉、自身免疫疾病等患者的血液中表达失调，对RA的诊断有一定价值［6-7］。

研究发现，miR-146a及miR-155在RA患者体中异常表达，与该病发生、发展有密切的关系［8］。冯佳等［9］采用实时荧光定量PCR技术检测了miR-146a及miR-155在RA患者外周血的表达水平，并结合关节疾病活动度评分（DAS28）、血沉（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白 M（IgM）、类风湿因子（RF）等指标，分析miR-146a及miR-155在RA检测中的意义。结果发现RA患者的miR-146a、miR-155表达上调，且与ESR、CRP、DAS28呈正相关，而与IgM、RF无相关性。认为miR-146a和miR-155在RA患者外周血淋巴细胞中的表达水平与RA病情活动性相关，可作为判断该病活动程度的有效指标。

核因子κB（NF-κB）的异常表达是RA的主要特点之一，NF-κB信号通路在RA炎症进程中发挥重要作用［10］。锌指蛋白A20对NF-κB信号通路和TNF-α介导的细胞凋亡信号通路起负调控作用［11］。朱丽花等［12］采用实时荧光定量 PCR 技术检测了RA患者外周血和关节液中A20和NF-κB基因的表达水平以及经治疗后该基因表达水平的变化。结果发现RA患者外周血A20的表达显著减少，而NF-κB的表达水平上调，经治疗后疾病缓解，A20的表达有所恢复。关节液中A20和NF-κB与外周血中的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ）可以调节多种基因的表达，并有抗炎作用［13］。研究显示，PPAR-γ激动剂吡格列酮具有较好的抑制胶原诱导性关节炎作用［14］。陈瑞林等［15］采用实时荧光定量PCR技术对PPAR-γ在RA患者的外周血单个核细胞中的表达水平进行检测。结果发现RA患者外周血单个核细胞中 PPAR-γ mRNA的表达与关节疾病活动度评分（DAS28）呈负相关，患者疾病活动度越低，PPAR-γ的表达水平越高，认为PPAR-γ的表达水平可作为判断RA疾病活动度的有效指标。

Xu GX 等［16］研究发现 miR-142-3p 通过靶向调控靶基因白介素-1受体相关激酶1（IRAK-1）的表达，从而影响下游转录因子的表达，如NF-κB、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等，导致炎症反应。赵涌等［17］采用实时荧光定量PCR技术检测了微小RNA（miR）-142-3P在RA患者的外周血单个核细胞中的表达水平，并分析其与ESR、CRP、RF临床指标的相关性。结果发现miR-142-3p在RA患者外周血单个核细胞中的表达增加，且和疾病的严重程度呈正相关，认为miR-142-3p可能参与了RA的发病。

研究表明，炎症因子白介素-17（IL-17）可诱导RA的滑膜细胞分泌IL-6、IL-8及血管内皮生长因子（VEGF）等，加重关节炎症反应及软骨破坏［18］。林锦骠等［19］采用实时荧光定量PCR技术检测RA患者外周血单个核细胞IL-17 mRNA的表达水平，酶联免疫吸附法测定血清抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP），免疫比浊法检测RF含量。结果发现RA患者血清中RF、抗CCP含量和IL-17 mRNA的表达均显著高于正常对照组，且呈正相关。提示抗CCP和RF含量及IL-17 mRNA表达的联合动态监测有助于RA的诊断和治疗。

基质金属蛋白酶（MMPS）是具有降解细胞外基质能力的蛋白溶解酶家族，在该家族中MMP-3被认为是产生软骨降解作用最主要的蛋白酶［20］。周磊等［21］采用实时荧光定量PCR检测了RA患者外周血单个核细胞MMP-3 mRNA的表达水平，发现RA患者MMP-3 mRNA的表达水平高于健康人群，活动期RA患者该基因的表达水平高于非活动期患者。提示MMP-3 mRNA的表达水平与RA的发病及疾病活动相关。

2 滑膜检测

RA是以慢性关节滑膜炎症、软骨吸收及骨质纤维化为主要特征的慢性炎症疾病。滑膜是RA的靶器官，关节滑膜细胞随着病情的恶化恶性增生，血管翳形成，并逐渐破坏关节软骨，最终导致关节变形及功能障碍。在RA发病的初期，以关节滑膜炎症为主要特征，一般尚未发生骨质破坏，若在发病初期诊断并及时治疗预后良好［22］。目前研究发现白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）及TNF-α等细胞因子与诱导关节滑膜炎症有关。

脂肪组织可分泌大量脂肪因子，如瘦素、脂联素等，参与炎症反应与免疫反应［23］。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是参与调控RA血管翳产生的关键因子之一［24］。王磊等［25］给予胶原诱导型关节炎鼠关节腔内注射脂联素，并观察其对小鼠发病的影响，采用实时荧光定量PCR检测HIF-1α、IL-17、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平，结果显示关节局部组织中HIF-1α、IL-17、IL-6的表达增加，TNF-α未见差异。同时又用不同浓度的AD刺激RA小鼠的滑膜成纤维细胞72 h，采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹技术（western blot，WB）检测HIF-1α、IL-17、IL-6和 TNF-α的表达水平，结果显示AD呈剂量依赖性地促进HIF-1α、IL-17、IL-6的表达水平，而TNF-α未见差异。

转化生长因子β激活激酶（TAK1）是发生炎症反应细胞信号传导上游重要的激酶，可能对关节炎症的发病有着重要调节作用［26］。MMPs家族是RA患者软骨破坏的主要家族，而基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）是MMPs家族的抑制剂，其中TIMP1可抑制多数MMP。兰忠煜等［27］收集了11例RA患者的滑膜组织，并对滑膜成纤维细胞进行体外培养，后采用转染的方法将TAK1特异的小干扰RNA导入RA患者的滑膜细胞中，探究TAK1对滑膜细胞中MMP9及TIMP1表达水平的作用。结果发现抑制TAKl在RA滑膜细胞中的表达，MMP9 mRNA的降低率为 74.76%，TIMP1 mRNA的沉默率为31.51%，虽同时降低，但两者之间的平衡被打破。研究发现转染技术可以抑制TAK1在RA滑膜细胞中的表达水平；MMP9 mRNA的表达水平显著下调，对于抑制患者的软骨破坏有重要意义；靶向抑制TAK1打破了MMP9 mRNA与TIMP1 mRNA之间的平衡，降低了RA患者软骨的破坏。

VEGF是血小板源生长因子（PDGF）家族的成员之一，具有促使血管翳的生成和提高血管通透性作用，在RA的早期就可出现。单味中药雷公藤的疗效肯定，雷公藤多苷片是雷公藤经提纯得到，它对RA、肿瘤等血管新生疾病有明显疗效。韩曼丽［28］采用实时荧光定量PCR检测了模型对照组、空白组、雷公藤多苷片组及沙利度胺阳性药对照组大鼠肺、心、肝、肾与滑膜组织中VEGF mRNA的表达水平，并进行了关节炎指数评分。结果发现雷公藤多苷片组、沙利度胺阳性药对照组大鼠的关节炎评分及关节肿胀度比模型组低，差异有统计学意义（P＜0.01）；雷公藤多苷片组大鼠不同脏器中VEGF mRNA的表达水平降低，且与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与沙利度胺阳性药对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。认为雷公藤多苷片治疗Ⅱ型胶原关节炎大鼠的作用机制可能与降低VEGF的表达水平有关。

3 关节液检测

研究证实，一些抗体含量在滑液中比在血清中更高［29］。在RA的诊断过程中，抽取患者关节液进行相关的抗体检测，对RA早期诊断及早期有效治疗有重要意义。

淋巴毒素 β 受体 （lymphotoxin β receptor，LTβR）是TNF-α受体家族的一个成员。研究发现，LTβR信号通路参与了T细胞活化，可诱导细胞的凋亡等，在RA等自身免疫性疾病的病程中起积极作用。小鼠的LTβR免疫球蛋白可以抑制关节炎敏感性，为RA的治疗提供新的思路［30］。邹安庆等［31］研究发现LTβB信号通路中的LTβR、磷酸化转录因子（ReLB）mRNA在RA患者的关节腔积液中表达水平高，认为其对于RA的诊断具有重要意义。

巨嗜细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）是主要由单核细胞、中性粒细胞及巨嗜细胞产生的一种促进淋巴细胞向炎症部位迁移并活化的因子［32］。郭大文等［33］采用实时荧光定量PCR技术检测了8位活动期RA患者滑液单个核细胞（SFMC）及血清单个核细胞（PBMC）中MIP-1 mRNA的表达水平，并检测了血清中CRP及滑液白细胞数。结果发现RA患者SFMC MIP-1α mRNA的表达水平较PBMC中的表达水平高，且与CRP、滑液白细胞数有正相关性。

4 其他组织检测

胡秋侠等［34］采用实时荧光定量PCR检测了RA患者的尿沉渣中miR-146a的表达水平，并分析了其与RA临床相关指标的联系。结果发现miR-146a在RA患者的表达水平高于健康人群，活动期患者的表达水平高于非活动期患者，非活动期患者的表达水平高于健康人群，且尿沉渣中miR-146a的表达水平与DAS28评分、ESR、CRP呈正相关。认为miR-146a可能参与了RA疾病的发生。

人参皂苷是人参中的主要有效成分。有研究证实，人参皂苷Rg1具有糖皮质激素样作用及抗炎和免疫调节作用［35］。对于胶原诱导型关节炎小鼠的炎症反应具有缓解作用［36］。蔺娜等［37］用TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs），再加入不同浓度的人参皂苷Rg1，培养24 h后采用实时荧光定量PCR及western Blot检测MMP-9及VEGF的表达水平。结果发现，人参皂苷Rg1可以抑制由TNF-α刺激HUVECs的MMP-9和VEGF mRNA及蛋白的表达，认为人参皂苷Rg1可能具有治疗RA的功用。

RA引起的骨质侵蚀或关节畸形，严重降低了患者的生活质量，一旦发生这种关节畸形便很难治愈。所以早期发现、有效治疗至关重要。实时荧光定量PCR技术已逐渐成为科研的主要工具，对RA患者或风湿模型的血液、关节滑膜、关节液及其他各组织中的研究逐渐深入，为解释RA的发病机制及治疗机制提供可能，有助于医生对疾病的诊断与治疗的实时监控。虽然该技术与传统的检测技术相比有着明显的优势，但却也有不足：设备要求高，检测费用昂贵，缺乏标准化的标准品及完善的质量评价体系。但随着科学技术的发展，对实时荧光定量PCR技术的研究逐步深入，设备与检测费用的降低及技术的普及，该技术运用于RA等疾病的早期临床诊断及相关实验研究将更加广泛。