二尖瓣退行性变相关分子信号通路的研究进展

刘良，刘晓红，徐志云

(第二军医大学长海医院，上海200433)

二尖瓣退行性变(DMVD)又称为二尖瓣黏液变性或二尖瓣脱垂综合征，是一种常见的心脏瓣膜病，在美国和西方发达国家，DMVD已成为引起二尖瓣关闭不全的最主要的原因。DMVD在人和犬两个物种均与年龄强相关，因此被认为是一种退行性疾病[1]。与DMVD相关的病理变化包括蛋白多糖过度沉积、弹性蛋白破碎、胶原蛋白破坏中断，这些变化将导致瓣叶明显增厚、瓣膜结构脆弱、瓣叶和腱索过度伸长，导致瓣叶膨出、脱垂或松弛，诱发腱索断裂。近年来随着相关研究的不断深入，学术界逐渐认识到DMVD是一种具有可识别信号机制以控制关键效应蛋白表达的疾病，而非不可避免的衰老过程。提高对DMVD相关信号传导通路的认识有助于临床工作者确定治疗策略。现将近年来DMVD相关信号传导通路的研究进展综述如下。

1 心脏瓣膜的结构

心脏瓣膜结构在脊椎动物中高度保守。成人心脏瓣膜叶片为三层分层结构，依血流方向，分别为内层的心房面(房室瓣中)和 室肌面(半月瓣中)，中层的海绵层以及外层的纤维层。在房室瓣，纤维层与腱索延续。各层细胞外基质的组成被认为反映了心脏瓣膜应对主要生物机械应力的功能定位。纤维层主要由环向取向的胶原蛋白纤维束组成，故瓣叶最外层呈波纹状，瓣叶在心脏舒张时能得到最大的舒展；海绵层主要成分为氨基葡聚糖，可吸收水分，使海绵层膨胀，以吸收瓣叶运动时所产生的冲击力，起到很好的缓冲作用，同时其亦是三层中细胞密度最低的一层；内层富含径向弹性蛋白，以应对瓣膜开放时血流侧的剪切力，使得瓣叶能够重复地开启闭合，同时也为纤维层提供反冲张力，使纤维层在伸展状态下能够恢复波纹形状，为下次的运动循环做准备。

心脏瓣膜的细胞主要由瓣膜内皮细胞(VEC)、平滑肌细胞和瓣膜间质细胞(VIC)组成。VEC覆盖瓣叶表面，CD31阳性，与血管内皮细胞功能相同。平滑肌细胞在近瓣叶血流侧薄层分布，可由平滑肌重链肌球蛋白的表达识别和定位。VIC为成纤维间叶细胞，其主要功能为通过不断合成和降解来维持细胞外基质组成。VIC在维持瓣膜功能及应对瓣膜终生承受的生物力学载荷中起到关键作用。鉴于瓣膜退变的根本是细胞外基质的失衡，心脏瓣膜退行性变的细胞介质首选VIC。Rabkin等[2]首次研究了“静态”VIC向“激活的肌成纤维细胞”的表型转化，发现VIC在人退行性二尖瓣中表达肌成纤维细胞骨架成分α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白以及间充质活化的标志物——非肌肉型肌球蛋白重链，并进一步证实激活的肌成纤维细胞增加基质分解代谢酶的表达，包括胶原酶(基质金属蛋白酶MMP-1和-13)、明胶酶(MMP-2和9)、弹性蛋白酶(组织蛋白酶K)。Disatian 等[3]亦证明了在犬DMVD的间质细胞中，α-SMA、结蛋白、非肌肉型肌球蛋白重链有着几乎同样的表达模式。如今普遍认为，VIC的表型转化与心脏瓣膜的病理变化密切相关。

2 DMVD的启动机制

化学和机械刺激均可触发相关分子信号通路，这些分子信号通路通过激活转录因子转而控制基因表达。

2.1 化学刺激 化学刺激源可能包括循环血液中血浆中的物质或心瓣膜附近的循环血细胞所释放的物质，其中循环血清素受到广泛关注。研究证实，与类癌综合征(肠嗜铬细胞瘤)相关的循环高血清素可诱导人类心脏瓣膜病。血清素导致心脏瓣膜病的机制与退行性心脏瓣膜病不同，但二者均以黏液变性为主，即与蛋白聚糖/蛋白多糖过度沉积相关。但由于血小板快速去除或通过肝和肺的细胞代谢，血浆中循环血清素水平通常很低，只有在血清素合成远远超过清除时，如在类癌综合征中，循环血清素水平才高到足以引起瓣膜病。当发生这种情况时，右心瓣膜首先受影响，原因在于血清素通过肺部清除。通过血小板释放而非依赖循环水平血清素，其生物学意义尚不清楚。 更多的生物学可能的是外源性血清素和其他化学刺激物可以通过血小板传递至心脏瓣膜。犬和人退行性二尖瓣表面均可通过电子显微镜扫描观察到内皮细胞剥蚀和血小板黏附[4]，内皮细胞剥蚀推测与二尖瓣反流相关的湍流模式引起。因此，对于DMVD，血小板黏附和释放化学刺激更表现为一个持续的过程而非触发的机制。

2.2 机械刺激 VIC通过重塑其细胞外基质来应对机械刺激。鉴于DMVD的根本是细胞外基质动态平衡失调，因此生物力学异常载荷可能是退行性瓣膜病的启动机制之一。加载于心脏瓣膜的生物机械力包括牵拉、剪切、压缩和弯曲[5]，任一或所有这些外力均可参与DMVD发病机制。高张力在退行性瓣膜病发病机制中可能发生的作用已受到广泛关注。高血压和遗传性结缔组织疾病(例如马凡综合征)是已知的人DMVD危险因素[6]。二者均可被认为增加了VIC的拉伸应变。有体外实验支持了拉伸应变作为DMVD启动机制的作用，Lacerda等[7]报道，与未处理组比较，犬二尖瓣通过静态或循环拉伸应变增加了α-SMA、肌球蛋白、胶原酶、组织蛋白酶K、木糖转移酶(糖胺聚糖合成酶)以及核心蛋白聚糖的表达。一个羊体内实验证实接近二尖瓣的湍流可诱发黏液变性[8]。这个实验支持异常剪切力在DMVD发生、发展中的作用，也同时论证了一个一直持有的理论:二尖瓣反流导致了更严重的二尖瓣反流。如果张力和剪切力在DMVD发病机制中起到启动和推动作用，关于启动退行性瓣膜病信号通路的具体的力学感受器和机械传导机制却尤未可知。考虑到VIC与细胞外基质的密切关系，VIC是逻辑上的张力传感细胞，而VEC响应剪切应力，因此VEC应有探测剪切应力的力学感受机制。

3 DMVD相关分子通路

3.1 血清素 血清素的合成由其限速酶色氨酸羟化酶(TPH)控制。TPH的两个亚型已经明确，周围神经系统亚型TPH1和中枢神经系统亚型TPH2。约95%的周围型血清素是由嗜铬细胞在肠内合成。血清素通过7个不同的血清素受体家族发挥作用，除一个以外，均属于Gp蛋白偶联受体超家族激活磷酸脂酶C。MAP激酶(一种细胞外信号调节激酶)是血清素的下游信号并介导其促进细胞增殖效果。血清素介导的细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化(ppERK)已在数种细胞中被发现，其诱导有丝分裂是依赖Rho激酶介导的ppERK核易位。血清素活性由血清素转运体经细胞摄取血清素方式终止，随后经单胺氧化酶代谢或存储于血小板。

高循环血清素或血清素药物可在人和大鼠诱发瓣膜病。在类癌综合征(嗜铬细胞瘤功能)，血浆血清素水平最高的患者发生瓣膜病的风险也最高[9]。右心瓣膜通常最受影响，原因在于血清素通过肺部清除。类癌瓣膜病被描述为瓣膜表面斑块形成，病理特征为成纤维细胞增殖，纤维化和黏液基质沉积[9]。研究发现，长期血清素注射的大鼠发生形态和功能类似的瓣膜病[10]；一些药物，包括芬氟拉明和麦角衍生药物，与心脏瓣膜病有关，尤其是二尖瓣病变[11]。如今的证据强烈提示血清素2B受体(5HT2BR)的特异性激活是血清素源性瓣膜病的发病机制[11]。血清素转运受体(SERT)敲除小鼠出现心脏瓣膜病原因考虑为心脏瓣膜中有效血清素增加。尽管血清素源性黏液变性与DMVD病变相似，但血清素在DMDV的发病机理中的直接作用尚未明确。

Oyama等[12]首次报道犬DMVD中5HT2BR转录水平上升。亦有报道在犬DMVD中5HT2BR蛋白丰度上升而SERT蛋白丰度下降，而ppERK升高并未改变ERK总量，与活跃的血清素信号一致[13]。重要的是，人和犬DMVD中TPH1表达升高数倍，在狗疾病早期和晚期TPH1表达均有上升，符合血清素可能是DMVD启动因素的理论[3, 13]。基于这些发现，有假说认为，DMVD是由局部血清素信号机制所介导的。Disatian等[3, 13]报道了静态和循环拉伸应变诱导培养的犬二尖瓣TPH1表达升高，局部血清素合成增加，并发现抑制TPH1或5HT2BR可减弱黏液变性效应蛋白在羊二尖瓣的表达。Cremer等[14]在猪体内实验中证实二尖瓣反流引起血清素受体相关基因表达增高，而TPH1和SERT 表达降低。这些研究支持DMVD患者的血清素水平升高是由于拉伸应变导致的。

3.2 转化生长因子β(TGF-β) TGF-β属于生长因子超家族，包括TGF-β的亚型TGF-β1～3、骨形态发生蛋白(BMPs)、活化素和抑制素[15]。TGF-β是由2个分子量为1 215 kD的亚基通过二硫键连接成具有生物活性的同源二聚体。其超家族根据其序列同源性和所激活的信号通路的不同分为两个亚家族:TGF-β/Activin/Nodal亚家族和BMP/GDF/MIS亚家族。哺乳动物主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3共3种形式。TGF-β信号分子通过跨膜的受体复合物进行信号转导,这些受体(TGF-βR)根据分子量大小可分为三型。Ⅰ型(50～60 kD)也称ALKs,包括7种；Ⅱ型(75～80 kD)包括5种；Ⅲ型(280 kD)。Ⅰ、Ⅱ型受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,Ⅱ型受体能以较高的亲和力与TGF-β2配体结合,并与Ⅰ型受体形成异源受体复合物,将Ⅰ型受体近膜的一段富含甘氨酸、丝氨酸残基的区域(GS结构域)磷酸化启动胞内信号级联反应。TGF-β超家族的二聚配体与细胞膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型受体具有高度的亲和力,结合形成异四聚体。在该复合物中,Ⅱ型受体在自主磷酸化同时可将Ⅰ型受体GS结构域磷酸化而激活,活化的TGF-βRⅠ使R2SmadSSxS区域两个丝氨酸残基磷酸化并与Smad4结合形成异三聚或四聚体进入胞核,与许多辅助活化因子和辅助抑制因子协同作用调节靶基因的转录[15, 16]。

TGF-β1过表达与几个心脏疾病有关，包括类癌性心脏病、钙化性主动脉瓣狭窄、风湿性心脏病等，其突出特征为纤维化[16]。研究证实，TGF-β亚型在犬退行性二尖瓣中强过表达，TGF-βRⅠ和RⅡ丰度亦有增高[13]；在体外培养的猪主动脉中，TGF-β1和15%的循环应变协同增加α-SMA表达和胶原合成[17]；TGF-β1在体外培养的VIC诱导糖胺聚糖合成[18]。而体外培养绵羊主动脉VIC中，血清素通过GP信号通路增加TGF-β1mRNA表达[18]。这些研究提示了一个在血清素信号、TGF-β信号和黏液变性效应基因及蛋白表达之间的功能联系。

3.3 发育调控信号通路 心脏瓣膜生成在脊椎动物中高度保守，并由发育调控通路调节，由基于受体的信号转导、转录因子及下游结构基因组成[19]。发育调控通路调节瓣膜生成，同时引导弹性大动脉、软骨、骨和腱的发展。被认为参与瓣膜发育最后阶段的具体通路包括[19]、Notch 1、BMP-Sox9信号通路、Wnt信号通路、FGF4信号通路。

3.3.1 BMP-Sox9 信号通路 Sox9是Y染色体性别决定基因相关高移动框转录因子。BMPs是TGF-β超家族的成员。BMPs通过Smad磷酸化与TGF-β直接关联[15]，其在发育和出生后的软骨形成中通过激活转录因子Sox9发挥作用[20]。Sox 9活化介导软骨聚集和软骨特异性结构基因包括蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、软骨连接蛋白和N-钙黏蛋白的表达[20]。BMP2在发展中的心脏瓣膜祖细胞中诱导Sox9和蛋白聚糖表达[21]。BMP2被认为在瓣膜分层时海绵层发育中发挥作用[19]。Sox9在人退行性二尖瓣病变中已有报道，但与正常二尖瓣比较其表达是否增加尚不清楚。鉴于软骨和黏液变性瓣膜病理形态相似性， BMP-Sox 9信号作为调控DMVD的候选信号通路是符合逻辑的。已有初步证据证明，犬和人退行性二尖瓣中Sox9、软骨聚集蛋白聚糖及软骨特异性II型胶原的局灶共存表达[22]。可以推论，退行性二尖瓣具有Sox9信号影响下形成的软骨灶。

3.3.2 Wnt 信号通路 Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其他生理过程中具有至关重要的作用。WNT信号通路调控胚胎发育及产后软骨疾病过程、成骨过程及软骨内成骨和骨密度特性[23]，Wnt3a和5a配体介导软骨形成，而其他配体介导骨形成。人类LRP-5基因突变致功能丧失或增益分别导致青少年骨质疏松和高骨质量综合征[24]。有研究表明，LRP-5通过抑制TPH1和嗜铬细胞合成血清素调节骨形成，血清素又直接抑制成骨[25]；LRP-5-Wnt-βcatenin信号通路与人退行性(钙化性)主动脉瓣疾病相关[26]。笔者根据上述研究结果提出一个设想，退行性瓣膜病包括一个病理过程，表现为退行性(钙化性)主动脉瓣中骨生成和退行性(黏液变性)二尖瓣中软骨生成。鉴于血清素可抑制成骨，笔者推测在二尖瓣局部合成的血清素可起到抑制成骨而促进软骨形成的作用。

3.3.3 Notch信号通路 Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。哺乳动物有4种Notch受体(Notch1～4)和5种Notch配体。Notch受体为单向跨膜蛋白，分胞内区和胞外区。Notch配体蛋白与胞外区结合，并诱导蛋白裂解为2个片段，N端裂解产物(胞外区)被配体表达细胞吞噬，而C端裂解产物进一步移动到细胞核调控下游基因表达，从而促进细胞增殖和抑制细胞分化。相邻细胞可以通过Notch受体与配体的结合传递Notch信号，从而扩大并固化细胞间的分子差异，最终决定细胞命运，影响器官形成和形态发生。Notch信号是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路。

Notch信号在早期心脏瓣膜发育上皮-间充质过渡阶段发挥作用[19, 27]。Notch信号被猜测在心脏瓣膜发育后期分层阶段通过探测瓣膜血流侧剪切应力发挥作用。Notch信号局部激活，因而建立瓣膜极性，并在房室层发育中发挥关键作用[19]。Notch信号突变与先天性主动脉瓣二叶畸形和成人退行性(钙化性)主动脉瓣疾病有关联[27]，但与DMVD无关， Notch信号可能通过VEC探测异常剪切应力，但尚未被证实。

3.4 一氧化氮(NO) 内皮细胞NO信号由钙/钙调蛋白调控的内皮型NOS介导。释放NO激活靶细胞溶解形态的鸟苷酸环化酶，反过来产生cGMP， cGMP通过激活cGMP依赖蛋白激酶发挥作用。内皮细胞释放NO由内源性血管扩张剂通过特定受体(如乙酰胆碱、缓激肽)和血流引起的剪切应力调控。已经证明孤立的猪二尖瓣释放NO[28]。猪血管内皮细胞释放NO依赖钙离子内流和内皮型NOS激活。ADP和凝血酶、缓激肽可增加其释放。在轻度黏液变性的猪二尖瓣中证实NO释放和内皮型NOS、诱导型NOS表达增加[29]。NOS活性与VEC相关，且与病理改变最大区域强烈相关。这些研究证实了DMVD中内皮型NOS活性和NO释放增加，但是是否NO介导了病理基因表达还是仅仅是对反流引起的乱流的应答尚无定论；NO在DMVD发病机制中的作用有待进一步研究。

3.5 血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ) AngⅡ是由血管紧张素Ⅱ转化酶转化AngI获得的一种多肽激素，通过Ⅰ型AngⅡ受体(AT1受体)调节细胞功能。AT1受体是G蛋白偶联受体，通过激活磷脂酶C和第二信使：三磷酸肌醇和蛋白激酶C发挥作用。AngⅡ参与了退行性二尖瓣反流相关的充血性心力衰竭的发生。亦有证据显示AngⅡ在人和犬心室重构中发挥作用。在人体外培养VIC观察到血管紧张素Ⅱ能有效刺激钙离子内流和胶原合成，但是AngⅡ在DMVD发病机制中的作用有待进一步研究。

近年来，退行性瓣膜病受到广泛关注，对介导退变进程的细胞和分子机制的研究已取得一定的进展。但这些研究大部分基于体外细胞和组织模型，仍有许多问题亟需解决，包括明确退行性瓣膜病启动因子、心脏瓣膜细胞的机械力感受器和传感机制、明确各种信号机制的复杂的相互作用。DMVD在犬和人表现出惊人的相似，许多证据表明犬自然发生的DMVD是一种非常有前景的慢性动物模型。基础研究得出的新的治疗策略已在犬中应用，最终将使人类受益。

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