不同来源间充质干细胞治疗卵巢早衰的作用及机制研究进展

刘荣霞，杨炳，余丽梅，赵春华

(1 遵义医学院附属医院，贵州遵义 563003；2 中国医学科学院基础医学研究所)

卵巢早衰(POF)是指女性在40岁之前出现的以卵巢功能过早衰竭(如月经稀发、闭经、不孕等)为主要临床表现的综合征，血清中雌激素水平降低和促性腺激素水平升高为其特征。POF发病率在30～40岁的女性中占1%左右，且呈上升趋势[1]。研究显示，37%的POF由抗肿瘤治疗等医源性因素引起，特发性占25%，遗传和免疫因素各占19%左右，不良生活、工作方式也为其诱因[2]。针对已知的发病原因和机制，POF目前主要的治疗措施包括激素替代治疗、促性腺激素释放激素受体激动剂治疗、冷冻组织(卵母细胞、卵巢组织、胚胎)移植、免疫调节、基因治疗等[1,3]。然而，这些治疗的效果主要以改善临床症状为主，难以完全恢复卵巢正常功能，还存在明显不良反应，如激素替代治疗增加致癌风险。因此，寻找一种恢复卵巢功能治疗手段显得尤为重要。近年来，间充质干细胞(MSC)疗法被认为是一种修复受损组织、重建正常组织功能的替代治疗手段，因其治疗范围广泛和潜在的临床应用价值，逐渐成为研究热点，也为包括POF在内的各种难治性疾病带来了新希望。现就不同来源MSC治疗POF作用及机制研究进展综述如下。

1 MSC治疗POF的可行性

MSC是来源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新、多向分化潜能、低免疫原性、分泌多种细胞因子、改善组织局部微环境、促进血管和组织再生等特性[4]。也有研究显示，MSC可通过上调Treg细胞、提高抗炎因子分泌、下调致炎因子水平，发挥免疫调节作用[5]。特定条件下，MSC可以定向诱导分化为三个不同胚层的细胞如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等[6]。因此，MSC被用于治疗类风湿性关节炎、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病、糖尿病、肝硬化、肺纤维化和心肌梗死、退行性疾病(脊髓损伤、帕金森病、阿尔茨海默病)等。目前，已有十余种干细胞制剂用于治疗移植物抗宿主病、急性心肌梗死、骨性关节炎等[6,7]，大量临床研究也正在积极开展中。与其他种子细胞不同，MSC来源广泛，存在于各种组织，如骨髓、脐带、脐血、羊膜、胎盘、外周血、脂肪组织、牙组织、子宫内膜等。尽管不同来源MSC存在一定生物特征与功能的差异，但MSC诸多的共同特性，使其成为临床治疗POF的理想制剂的候选者。

2 骨髓MSC治疗POF的作用及机制

近年来，较多的研究报道了骨髓MSC治疗POF的良好效果。将骨髓MSC以4×106个细胞/kg腹腔注射到环磷酰胺诱导的POF大鼠，或经尾静脉注射至顺铂诱导的POF大鼠体内，骨髓MSC均可以很快迁移、归巢到受损的卵巢，通过降低DNA损伤和减少卵泡凋亡来保护化疗引起的性腺毒性，加速卵巢组织的修复。由于血管丰富程度或局部趋化因子或趋化因子受体分布的差异，移植的骨髓MSC主要分布在卵巢门和髓质，少量分布于卵巢皮质，卵泡、黄体中则未发现骨髓MSC，也未获得骨髓MSC分化为卵泡和颗粒细胞的证据，提示骨髓MSC对卵泡发育和颗粒细胞的修复效果可能涉及MSCs的旁分泌效应，或促血管生成与改变卵巢微环境，进而促进卵巢组织再生和功能恢复[8]。也有研究发现，环磷酰胺引起卵巢组织中TNF-α水平升高，趋化骨髓MSC向受损的卵巢迁移，骨髓MSC则分泌IGF-1，其一方面促进卵巢血管再生，另一方面上调卵巢组织Bcl-2表达，阻止下游凋亡信号的激活，减少卵巢颗粒细胞凋亡，增强卵巢组织抗氧化应激能力[9]。静脉移植骨髓MSC至POF动物体内，活体示踪或免疫组化检测，都仅见较少的骨髓MSC分布于卵巢，一定时间内MSC大量的肺滞留或二次分布是否影响治疗效果，是否存在非预期分化，产生非预期的不良影响，还不得而知。进而研究者在体外用miR-21基因的慢病毒载体转染骨髓MSC，发现miR-21不仅可以增加骨髓MSC对化疗的耐受，而且可以减少骨髓MSC的凋亡，增加骨髓MSC活力。转染miR-21的骨髓MSC在体外与磷酰胺氮芥损伤的颗粒细胞共培养，可明显减少颗粒细胞凋亡。原位注射转染miR-21的骨髓MSC至POF大鼠卵巢组织，可见卵巢组织中miR-21表达上调，其靶向沉默下游基因10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因(PTEN)和程序性细胞死亡基因4(PDCD4)，颗粒细胞凋亡明显减少，POF大鼠卵巢结构和功能得到了更好的恢复，显示了一种增强型骨髓MSC对POF具有良好疗效。也提示，miR-21修饰的骨髓MSC作用机制，与miR-21下调PTEN表达有关，即PTEN可能激活PI3K/Akt通路，诱导卵巢细胞生长、增殖，抑制细胞凋亡；同时miR-21抑制LPS信号通路，下调PDCD4，抑制下游IL-10和NF-κB表达，抑制细胞凋亡[10]。最新研究发现，骨髓MSC可以明显提高生长期卵泡中抗苗勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、抑制素A和抑制素B的表达水平；上调卵巢组织卵泡发育相关基因Nano3、Nobox、Lhx8 mRNA水平，促进POF小鼠卵巢组织结构修复和卵泡发育[11]。虽然骨髓MSC在POF治疗方面取得了一定的成果，但其临床应用还需临床试验进一步明确，骨髓MSC采集的有创性及年龄等因素影响骨髓MSC质量，降低了骨髓MSC临床应用的可行性。

3 羊水干细胞(AFSC)治疗POF的作用及机制

AFSC具有许多与MSC相似的生物学特性，将红色荧光蛋白RFP标记的CD44+/CD105+AFSC，原位注射到环磷酰胺诱导的POF小鼠，卵巢内RFP荧光至少可观察到3周，BrdUrd掺入法和免疫荧光染色则显示，CD44+/CD105+AFSC在POF小鼠的卵巢组织中可保持长期增殖和自我更新，且具有正常的细胞周期。将AFSC移植到化疗诱导POF的小鼠体内，免疫荧光和免疫组化结果均显示，人特异性细胞核抗原和卵泡刺激素受体(FSHR)主要表达在卵母细胞周围，说明AFSC分化为颗粒细胞。AFSC移植后POF小鼠卵巢组织中AMH表达上调，后者可以通过抑制FSH，抑制过多的卵泡募集，控制原始卵泡形成，说明AFSC既可以直接分化为颗粒细胞促进卵泡的形成，也可以通过上调AMH表达，间接恢复POF小鼠卵巢储备功能。但也有研究报道，AFSC移植入白消安联合环磷酰胺诱导的POF小鼠卵巢，AFSC仅分布于卵巢间质而不形成卵泡，既不表达生殖细胞标志分子VASA，也不表达颗粒细胞标志蛋白FSHR，且AFSC移植组和非移植组健康卵泡数、闭锁卵泡数量没有明显的差异，表明AFSC主要是通过阻止卵泡闭锁，增加健康卵泡数量而恢复卵巢的功能和POF小鼠生育能力[12]。最近的研究发现，AFSC分泌的外泌体中富含miR-146a和miR-10a，其中miR-146a通过下调Irak1和traf632表达，miR-10a通过抑制Bim表达，下调Caspase-9表达，从而抑制颗粒细胞凋亡和预防卵泡闭锁，恢复损伤卵巢的功能[13]。然而，AFSC需从超声引导下获取的羊水中分离，采集量、采集时间都十分受限，尤其是孕妇及胎儿存在风险这些因素很大程度地上限制了AFSC的临床应用。

4 羊膜MSC(AMSC)治疗POF的作用及机制

AMSC可以分泌大量的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型胶原，这些胶原可以使AMSC在POF小鼠体内存活更长的时间，提高AMSC的治疗效果。AMSC也高表达转录因子OCT4和Nanog，后者通过JAK/STAT信号通路提高生长因子如骨保护蛋白、HGF、BDNF、TGF-β2、EGF和FGF-7，趋化因子如MCP-3、MCP-2、MIP-3-α、GCP-2、ENA-78和LIF的表达，促进颗粒细胞增殖，恢复损伤卵巢功能[14]。也有研究发现，与AMSC相比，低强度脉冲超声波预处理的AMSC能更有效地恢复POF大鼠的卵巢功能，推测其机制可能为，低强度脉冲超声波预处理的AMSC能更有效地上调IGF-1、HGF、VEGF、FGF2水平，下调促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，并减少卵巢生殖干细胞的耗竭和改善生殖干细胞的微环境，促进生殖干细胞分化为原始卵泡，修复损伤的卵巢组织。AMSC也可以通过减少TNF-α和促凋亡因子Bax表达，或增加抗凋亡因子Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比例，抑制颗粒细胞凋亡，促进卵泡生长，进而恢复卵巢功能[15]。本课题组此前的研究也证实AMSC对双氧水局部损伤和顺铂所致POF均具有明显治疗效果，不但改善卵巢组织病理学变化，促进成熟卵泡发育，还可恢复小鼠血清雌激素与FSH水平及生育功能。

5 胎盘源性MSC(PMSC)治疗POF的作用及机制

有研究报道，PMSC移植可以明显改善透明带糖蛋白3(ZP3)诱导的POF小鼠高促性腺激素、低雌激素血清水平，促进卵泡发育，抑制过多卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡，提高卵巢储备能力。PMSC的作用机制可能涉及PMSC分泌多种细胞因子，减少窦前卵泡和囊状卵泡中颗粒细胞凋亡，而颗粒细胞分泌的多种细胞因子则通过TGF-β/Smad信号通路，上调AMH的表达，后者抑制原始卵泡募集和卵泡发育，避免原始卵泡池过早耗竭，改善卵巢储备能力，恢复POF卵巢功能[16]。另有研究认为，PMSC可上调POF小鼠血清中TGF-β水平，降低IFN-γ的水平，促进Treg细胞增殖，减少颗粒细胞凋亡，恢复卵巢功能。IFN-γ可以启动卵泡闭锁过程，刺激颗粒细胞中MHCⅠ和MHCⅡ的表达，导致卵泡破坏，而PMSC移植降低血清中IFN-γ水平，明显阻断上述过程的发生，减少次级卵泡和囊状卵泡中颗粒细胞凋亡；PMSC可能分泌TGF-β，不仅在卵泡生成早期阶段发挥刺激作用和调节原始卵泡池，而且刺激Treg细胞增殖。这可能为PMSC恢复POF的主要机制[17]。也有研究发现PMSC可以使Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信号通路，减少POF小鼠卵巢中颗粒细胞凋亡和降低Th17/Tc17及Th17/Treg细胞的比例，从而改善卵巢功能[18]。最近发现，PMSC移植可以降低POF大鼠体内解耦联蛋白-2(UCP-2)、超氧化物歧化酶1(SOD1)和活性氧、8-羟基脱氧鸟苷水平，提高体内线粒体功能，抑制氧化应激，从而减少环磷酰胺对卵巢造成的损伤。可能的机制为，UCP-2通过解耦联作用调控线粒体膜电位，进而改变线粒体ROS合成的量与速度，减轻氧化损伤，维持线粒体ATP的合成及线粒体的生物修复功能，最终保护卵巢线粒体形态结构及功能。

6 脐带MSC(UCMSC)治疗POF的作用及机制

静脉注射UCMSC至环磷酰胺诱导的POF小鼠，能明显减少颗粒细胞凋亡，增加卵泡数量，提高雌激素水平，有效恢复卵巢功能。一方面，UCMSC可能通过旁分泌机制，刺激颗粒细胞生长而发挥治疗作用；UCMSC也可以上调卵巢干细胞功能蛋白如AKR1C18和Ly6a(Sca-1)、细胞循环控制蛋白CDKN2B水平，促进卵巢再生；另一方面UCMSC通过再次激活宿主的卵子，或间接调节卵巢微环境减少颗粒细胞凋亡恢复卵巢功能。UCMSC不但可减少环磷酰胺对卵巢组织的损伤，甚至还可修复环磷酰胺引起的成熟卵泡损伤，部分恢复大鼠卵巢内分泌和生殖功能。作用机制主要为UCMSC分泌VEGF、IGF-1和HGF，抑制次级卵泡和囊状卵泡凋亡，促进血管生成[19]；UCMSC也可能通过增加SOD2和过氧化氢酶表达，增强抗氧化和抗凋亡酶基因表达，减少细胞凋亡而减轻卵巢的氧化损伤[20]。UCMSC也可分泌多种生长因子，逆转环磷酰胺阻断的雌二醇和AMH对FSH的负反馈作用，阻止生长卵泡过度耗竭，最终改善卵泡的发育[21]。UCMSC分泌的外泌体可以融入顺铂损伤的卵巢颗粒细胞，通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达，减少Caspase-3活化，增加DNA修复酶PARP表达，加速卵巢功能的恢复。外泌体所携带microRNA-24、microRNA-106a、microRNA-19b和microRNA-25可能也参与了抗卵巢颗粒细胞凋亡的效应[22]。最新的研究证明，体外将卵巢与附着在胶原上的UCMSC共培养，能更有效的磷酸化原始卵泡中的FOXO3a和FOXO1，促进卵泡发育、成熟，也可在体内刺激卵泡生长至排卵前阶段，使体内受损的卵巢功能和自然受孕能力得到明显改善。与胶原上共培养，增加UCMSC AKT的T308位点磷酸化，AKT转位至细胞核，磷酸化FOXO3a，最终激活原始卵泡，而磷酸化的FOXO1也可能以原始卵泡颗粒细胞为靶点，调节mTORC1活性，激活早期卵泡发育，促进颗粒细胞增殖、减少颗粒细胞凋亡。胶原共培养的UCMSC移植到POF患者体内，也可以明显增加UCMSC在患者卵巢的滞留时间，有利于UCMSC长期治疗效应的发挥[23]。

7 脂肪来源干细胞(ADSC)治疗POF的作用及机制

ADSC也具有MSC的特征，且因其来源广泛、取材容易、低损伤、易扩增等原因，逐渐受到研究者的广泛关注。Angpt1表达上调与促进卵泡生长和血管生成有关，Zcchc11则通过上调IGF-1刺激颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡和促进卵泡腔形成。研究发现，ADSC移植治疗环磷酰胺诱导的POF小鼠，可明显上调Angpt1、Zcchc11和Onecut2基因表达，下调CXCR4表达，促进原始卵泡发育为成熟卵泡，但未见ADSC直接分化为卵泡细胞。ADSC同样可通过分泌HGF、VEGF、TGF-β和PGF等细胞因子，减少颗粒细胞凋亡，增加卵泡数量，恢复卵巢功能。注射部位缺血、炎症、细胞凋亡等因素都不利于ADSC在靶器官内定植，且ADSC移植入体内可迅速扩散到周围的组织或器官甚至迅速死亡。因此，与单独注射ADSC相比，将ADSC与胶原共培养后注射入POF大鼠体内，能更好地恢复动情周期、雌二醇水平、卵泡发育及生育能力，这与胶原为ADSC提供适合迁移、定位、发挥功能的3D微环境并增加ADSC在卵巢的长期滞留有关，也可能为胶原能促进ADSC分泌VEGF、TGF-β1、FGF2和HGF，促进颗粒细胞增殖和血管生成所致[24]。

8 经血来源的MSC(MenSC)治疗POF的作用及机制

MenSC主要从女性经血中提取，具有获取无创、方便、可重复采集、伦理限制小等优点。研究发现MenSC不仅表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSC表面分子，还具有MSC的形态和干性特性，表达胚胎干细胞表面标记SOX2、SSEA4、c-MyC和Nanog，比其他来源的成体干细胞更接近于胚胎干细胞。有研究报道，原位注射MenSC，POF小鼠的卵巢重量、血浆雌二醇水平和正常卵泡的数量均随时间延长而增加，FSH水平则明显降低，卵巢组织表达更高水平的AMH、抑制素α/β、FSHR及Ki67，且微阵列分析发现，MenSC移植后小鼠卵巢组织cDNA基因表达类型与人卵巢组织越来越相似，且MenSC可被诱导分化为卵巢颗粒样细胞[25]。也有研究者认为，化疗产生的炎症信号刺激MenSC归巢至损伤的卵巢，尤其是定位在卵丘细胞，可显著改善卵巢微环境，刺激生殖干细胞池更新或刺激原始卵泡向成熟卵泡发育，从而恢复POF的卵巢功能[26]。最近的研究发现，MenSC不但可以减少POF小鼠颗粒细胞凋亡，还可分泌IGF-1、VEGF、HGF、G-CSF，减轻卵巢间质纤维化，促进卵巢组织血管再生改善卵巢微环境，进而增加卵泡细胞数量，恢复性激素正常水平[27]。

9 其他MSC治疗POF的作用及机制

少量研究还报道了，皮肤源性的MSC也能改善化疗诱导的POF，其机制与减少卵巢中TNF-α、TGF-β和IFN-γ等促炎因子表达水平，减轻卵巢炎症反应和损伤，改善局部微环境，促进卵子的生成有关[28]。也有研究显示，脐血和绒毛膜源性的MSC同样也可以恢复POF小鼠的卵巢功能[29,30]。

综上所述，不同来源的MSC在治疗POF方面有着相似疗效，并可能通过相似或不同的机制发挥治疗作用，这些都预示着MSC在POF治疗方面具有诱人的临床转化应用前景，尤其在恢复POF者生育功能方面，甚至在POF所并发的女性衰老方面，都有着巨大的市场需求。因此，针对已知的POF致病原因或机制，全面而深入地评价MSC移植治疗的安全性和有效性，尤其是对亲代和子代长远影响的评价，仍是亟待解决的关键问题。